乌塌菜复等位基因雄性不育系的定向转育.doc

精品论文乌塌菜复等位基因雄性不育系的定向转育王秋实，冯辉，刘志勇（沈阳农业大学园艺学院，沈阳市 110161）5摘要：本研究设计了一个“定向转育方案”转育复等位基因雄性不育系，用以解决乌塌菜杂种生产难题。以奶白菜复等位基因雄性不育系为不育源， 以乌塌菜高代自交系为目标品 系，利用连续回交的方法同时转育不育性和其他植物学性状。采用测交的方法鉴定植株基 因型。成功的将不育基因从 “s01”转入“wt01”中，育成了新的乌塌菜雄性不育系， 其具有 100%不育度和 100%不育株率且植物学性状与目标亲本相似。由不育系 gms-4 作为10母本配制了四个杂交组合，从中选出一个最优杂交组合 c1。关键词：蔬菜学；乌塌菜；核基因雄性不育；转育中图分类号：s634.4directional transfer of a multiple-allele male sterile line in15brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino var.rasularis tsen et leewang qiushi, feng hui, liu zhiyong(depertment of horticuture, shenyang agricultural university, shenyang, 110161)abstract: to produce hybrid seeds of wutacai (brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino20var. rosularis tsen et lee), a “directional transfer program” was designed to breed themultiple-allele male sterile line of wutacai. a multiple-allele male sterile line of naibaicai (brassica campestris l. ssp. chinensis l., s01) was used as the male sterile resource, and an inbred line of wutacai (wt01) was used as the target line. recurrent backcrossing was employed to transfer the male sterility and other botanical traits simultaneously, while the genotype was25identified through test crossing. the male sterility was successfully transferred from s01 to wt01.a new male sterile line, gms-4, with similar botanical traits to wt01, a 100% sterility degree and a 100% sterility rate, was bred. four hybrid combinations were generated with gms-4 as the female parent. one hybrid (c1) that contained the most desirable traits was developed from thenew male sterile line.30key words: vegetable; brassica campestris l. ssp. chinensis (l.) makino var. rosularis tsen etlee; multiple-allele male sterile line; breeding0引言乌塌菜（brassica campestris l. ssp. chinensis（l.）makino var. rosularis tsen et lee）原产于35中国，是芸薹属白菜亚种的一个变种，广泛分布于长江流域1。乌塌菜叶色墨绿，叶面褶皱 有光泽，莲座叶排列紧密，成轮状生长，外形美观，有“叶牡丹”的美称2。乌塌菜口感鲜嫩 爽脆，富含丰富的 vc，因此被称为“维他命”菜，同时含有丰富的胡萝卜素、钙、铁、磷、 锌等微量元素3。乌塌菜是一种典型的两性花异花授粉作物，杂种优势显著4。于缺乏理想的杂交制种手基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20092103110001)作者简介：王秋实(1983-)，女，博士研究生，主要研究方向：蔬菜遗传育种通信联系人：冯辉（1961-），男，教授，主要研究方向：蔬菜遗传育种. e-mail: - 10 -40段，目前生产上使用的品种为常规品种。雄性不育是开发利用杂种优势的一种重要手段5-7。 这种方法不仅能保证高质量的杂交种纯度，同时可以保护育种者的知识产权。许明和魏毓棠 8将 ogura 细胞质雄性不育性转入乌塌菜中，不育性可达 100%，但是其存在种种缺陷，例 如叶片黄化，蜜腺退化，生长缓慢等，不能广泛的应用于杂交种生产。冯辉9发现了大白菜 复等位雄性不育材料，并提出了“核复等位基因雄性不育遗传假说” ，根据这一假说，不育45性受细胞核内同一位点 msf、ms 和 ms 三个复等位基因控制。其中，ms 为不育基因，msf为恢复基因，ms 为可育基因。三者之间的显隐关系为 msfmsms。甲型“两用系”不育株基 因型为“msms”，可育株基因型为“msfms”，临时保持系基因型为（msms）。用甲型“两用系” 内不育株（msms）与临时保持系（msms）杂交，即可获得具有 100%不育株率的雄性不育系（msmsmsmsmsms）。甲型两用系可通过系统内不育株与可育株兄妹交的方式来保存50（msms msfms msms, msfms）(图 1)。这种不育材料以不育性稳定和完全不育为特 征，并且没有细胞质的负面影响。徐巍10以该假说为依据，将青梗白菜复等位雄性不育转入 乌塌菜中，育成了具有 100%不育率的乌塌菜核不育系，然而这一不育系是由两个不同亲本转 育而成，遗传背景存在较大差异，使得由此不育系配成的 f1 代杂交种整齐度差。本研究旨在找到适当的方法来转育乌塌菜不育系。采用了新的不育材料奶白菜核复等位55基因雄性不育系为不育源，设计了“定向转育方案”来转育乌塌菜不育系。图 1 大白菜复等位基因雄性不育系遗传模式fig.1. genetic model for multiple-allele male sterile line in chinese cabbage1材料方法601.1材料本研究所用材料均由辽宁省十字花科蔬菜重点实验室提供。采用奶白菜不育系 s01 为不 育源和测交材料。乌塌菜高代自交系 tw01 为待转育亲本。品比实验选用四个性状优良、稳 定遗传的乌塌菜常规品种的高代自交系 p1、p2、p3、p4 为父本，以日本品种vitamin为 对照。651.2方法本试验于 20082011 年在沈阳农业大学园艺研究基地进行。每年完成两个有性世代繁 殖。春季在日光温室播种育苗，待真叶长到 67 片时，移栽至 22cm 直径泥盆中，5 月末开 花授粉，采用套袋隔离，常规手工授粉技术。秋冬季利用日光温室加代。种子在 2c 冰箱中 春化 25 天。测交鉴定的材料春花后直接在穴盘中育苗，不需要移栽定植，待到抽薹开花直70接进行育性鉴定。 采用常规有性杂交、自交、回交和测交方法实施转育。在每一个回交世代选择与轮回亲本植物学性状相似的植株。样本容量和适合性测验分别采取、两式。样本容量公式:n log（0.01）/log(1-p)75 有育性分离的进行卡平方测定考查其适合性：x2= (oe)2/e其中 p 为出现的概率，o 为实测值，e 为理论值。 采用化学方法对叶片营养成分进行测定：包括 vc、可溶性糖、蛋白质、有机酸、粗纤维含 量以及微量元素含量。vc 含量的测定采用分光光度计法11；可溶性糖含量的测定采用蒽酮 法12；蛋白质含量的测定采用考马斯亮兰 g-250 法13；有机酸含量的测定采用酸碱滴定法；80粗纤维含量的测定采用酸碱洗涤法14；微量元素的测定采用原子吸收分光光度法15。2结果与分析2.1乌塌菜待转育品系 wt01 基因型的确定根据“大白菜核不育复等位基因遗传假说”，普通可育品系在核不育位点上的基因型有 4种：msfmsf、msms、msfms 和 msfms，由于 msfms 基因型在育种过程中发生性状分离而被淘85汰，剩余 3 种基因型可以通过与甲型两用系不育株（msms）杂交后代的育性分离比率加以 鉴别。以奶白菜甲型两用系不育株（msms）为母本，与乌塌菜待转育品系 wt01 杂交， f1代 45 株全部为可育株，证明待转育品系wt01的基因型为 msfmsf （图 2）。90图 2 tw01 基因型鉴定fig. 2 genotype identification of the target line tw012.2定向转育遗传模式按照可育品系基因型测定的结果设计定向转育遗传模式，选择基因型为 msms 的奶白菜95不育系为不育源，基因型为 msfmsf 的目标品系作为轮回亲本。不育源与乌塌菜亲本杂交后， 以“甲型两用系方向”来表示各回交世代中用于筛选甲型两用系的群体，同样，“临时保持系 方向” 用来表示各回交世代中用于筛选临时保持系的群体。如图 3 所示。100105110图 3 乌塌菜复等位基因雄性不育系定向转育模式fig. 3. genetic model for directional transfer of the multiple allele male sterile line inwu ta cai2.3转育结果分析如表 3 所示，不育系（msms）与轮回亲本（msfmsf）杂交后，f1 后代基因型有 msfms 和 msfms 两种，鉴定的方法是：随机选取 7 株 f1 代植株自交获得的 f2 群体。根据 f2 群体植 株育性分离比率来确定 f1 代植株基因型。结果见表 1。表 1 f2 代植株可育与不育分离比率代号可育株/不育株 理论分离比率0.05, 1(s01wt01)-150/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-235/133:1(0.111)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-336/123:1(0.000)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-439/143:1(0.057)msfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-546/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-649/0all fertilemsfmsmsfmsf, msfms, msms(s01wt01)-739/163:1(0.491)msfmsmsfmsf, msfms, msmstab 1. segregation ratio for fertility and sterility in the f2 generation(x2= 3.84) f1 植株基因型 f2 群体基因型115同时这 7 株 f1 植株与轮回亲本回交来建立 bc1 群体。根据 f1 植株基因型鉴定结果将bc1 代的植株分为甲型两用系方向和临时保持系方向（表 2）。在下一世代中，从 bc1 代两 个方向的群体中各选出 7 株植株分别与轮回亲本回交，同时这些植株与 s01 测交鉴定基因型， 即得到了 bc2 群体。在 bc2 群体中，选择基因型为 msfms 和 msfms 的植株继续进行回交转 育，即 bc2 代两用系方向 msfms 植株和临时保持系方向 msfms 植株被保留，淘汰 msfmsf 植株（表 3）。测交鉴定遗传模式如图 4。按照这一程序，选育出 bc3，bc4 代甲型两用系方向和临时保持系方向。120fig. 4. genetic model for test cross表 2 bc1甲型两用系方向和保持系方向的鉴定tab 2. identification of the ab line direction and temporary maintainer direction in bc1125回交一代转育方向f1 植株基因型bc1 植株基因型(s01wt01)-1wt01保持系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-2wt01两用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-3wt01两用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-4wt01两用系方向msfmsmsfmsmsfmsf(s01wt01)-5wt01保持系方向msfmsmsfmsmsfmsf( s01wt01)-6wt01 (s01wt01)-7wt01保持系方向两用系方向msfmsmsfmsmsfmsmsfmsfmsfmsmsfmsf表 3 bc2 代植株 msfms 基因型和 msfms 基因型的鉴定tab 3. genotype identification results of msfms and msfms in the bc2 generation可育株/代号理论分离比率植株基因型(x不育株20.05, 1= 3.84)s01 (bc1-4wt01)-149/0all fertilemsfmsfs01( bc1-4wt01)-223/271:1(0.320)msfmss01 (bc1-4wt01)-346/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-4wt01)-442/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-4wt01)-520/271:1(1.160)msfmss01( bc1-4wt01)-622/261:1(0.400)msfmss01 (bc1-4wt01)-749/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-148/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-245/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-343/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-448/0all fertilemsfmsfs01 (bc1-5wt01)-540/173:1(0.708)msfmss01 (bc1-5wt01)-638/143:1(0.103)msfmss01 (bc1-5wt01)-746/0all fertilemsfmsf130表 4 所列为乌塌菜各回交世代入选的植株基因型鉴定结果，测交结果接近理论分离比率同时植物学性状与亲本相似的植株入选。经 4 次连续回交后，每个方向选 7 株植株自交，同 时测交。根据测交结果，选择基因型为 msfms 和 msfms 植株的自交后代作为目标群体，来 筛选甲型两用系和临时保持系（表 5）。135表 4 雄性不育系定向转育过程中各个世代入选植株基因型的鉴定结果tab 4. genotype identification of selected plants in each backcross generation during transfer of the male sterile line回交代号植株代号可育株/ 理论分离比率不育株 (x2 = 3.84) 植株基因0.05, 139/14 3:1(0.057) msfmsbc1(f1wt01)-4bc2( bc1wt01)-622/261:1(0.400)msfmsbc3(bc2wt01)-724/221:1(0.087)msfmsbc4(bc3wt01)-624/231:1(0.021)msfmsbc1(f1wt01)-546/0all fertilemsfmsbc2( bc1wt01)-638/143:1(0.103)msfmsbc3(bc2wt01)-139/143:1(0.057)msfmsbc4(bc3wt01)-738/153:1(0.308)msfms型140表 5 bc4 代自交后代基因型的鉴定tab 5. genotype identification of progenies from bc4 selfing转育方向 自交组合测交结果理论分离比率(x可育/不育20.05, 1植株基因型= 3.84)两用系方向bc4-625/231:1(0.083)msfmsf, msfms, msms保持系方向bc4-739/103:1(0.551)msfmsf, msfms, msms145150在甲型两用系方向植株 msfms 的自交群体中，存在三种基因型，包括 msfmsf, msfms 和 msms，表现为 3：1 的育性分离比率。随机选择 5 株可育株（msfmsf，msfms）分别与不育 株（msms）兄妹交，若兄妹交后代群体植株育性表现为 1:1 分离，则该兄妹交群体即为回 交 4 代甲型两用系（表 6），在临时保持系方向植株 msfms 的自交群体中也存在 3 种基因型，即 msfmsf, msfms 和 msms, 表现型为全可育。随机选择 16 株自交，同时与甲型两用系方向 的不育株（msms）测交，测交后代全不育者，证明被测植株的基因型是 msms，即回交 4 代临时保持系（表 7）。挑选甲型两用系中的优秀植株与保持系杂交，即获得了乌塌菜复等位雄性不育系，gms-4（表 8）。表 6 甲型两用系方向兄妹交基因型鉴定tab 6. genotype identification of sib mating in the ab line direction不育株/代号理论分离比率植株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)a-s-1b-f -125/241:1(0.020)msfmsa-s-1b-f-227/231:1(0.320)msfmsa-s-1b-f-349/0all fertilemsfmsfa-s-1b-f-450/0all fertilemsfmsfa-s-1b-f-522/261:1(0.333)msfms注： a-s 代表 bc4-6自交后代中的不育株；b-f 代表 bc4-6 自交后代中的可育株。155160表 7 临时保持系方向植株基因型的鉴定tab 7. genotype identification of the temporary maintainer line direction不育株/代号理论分离比率可育株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)a-s-2(bc4-7)-126/23 1:1(0.184) msfms a-s-2(bc4-7)-2 50/0 all fertile msfmsf a-s-2(bc4-7)-329/21 1:1(1.280) msfms a-s-2(bc4-7)-4 0/45 all sterile msms a-s-2(bc4-7)-525/22 1:1(0.191) msfms a-s-2(bc4-7)-6 0/44 all sterile msms a-s-3(bc4-7)-727/26 1:1(0.019) msfms a-s-3(bc4-7)-8 48/0 all fertile msfmsf a-s-3(bc4-7)-920/26 1:1(0.783) msfmsa-s-3(bc4-7)-1022/27 1:1(0.510) msfmsa-s-3(bc4-7)-1122/26 1:1(0.333) msfmsa-s-4(bc4-7)-120/44 all sterile msmsffa-s-4(bc4-7)-1349/0 all fertile ms msffa-s-4(bc4-7)-1442/0 all fertile ms msa-s-4(bc4-7)-1524/27 1:1(0.176) msfms4a-s-4(bc -7)-1625/23 1:1(0.083) msfms165表 8 乌塌菜雄性不育系基因型鉴定tab 8. genotype identification of the male sterile line of wutacai代号 组合不育株/理论分离比率植株基因型(x可育株20.05, 1= 3.84)170gms-4 a-s-2(bc4-7)-40/45 all sterile msms2.4雄性不育系不育性的评估为了评价乌塌菜不育系的“不育度”，从 100 棵植株中随机选择 1000 朵花（每株每花序10 朵，其余去除）套袋隔离，防止外界授粉。记录由授粉袋内花朵所结种荚数。为了评估“不 育率”，种植 100 株 gms-4 植株，记录每棵植株花朵育性（有花粉的植株）。结果表明，gms-4 不育性稳定且彻底，具有 100%不育度和 100%不育株率。图 9 gms-4 的育性鉴定tab 9. fertility identification of gms-4 in the wutacai不育系总花数结种子数不育度总株数可育植株不育率gms-410000100%1000100%1752.5杂交组合产量分析采用随机区组实验调查小区产量，小区面积 3m1.5m，株行距 30 cm 50 cm。利用新 育成的 gms-4 作为母本与四个优良自交系 p1, p2, p3, p4 杂交，获得四个杂交组合。进行品比 实验。vitamin 品种作为对照。方差分析结果如表 10 所示，处理间达到极显著差异水平。 采用新复极差法进行多重比较，结果表明 c4 和 c1 组合产量极显著高于对照，小区产量分 别达到 15.81 kg，14.82 kg。180图 10 乌塌菜杂交组合小区产量tab 10. plot yields of hybrid combinations in wutacaireplicationplot yieldcodecombination kg/4.5m2ck vitaminc1gms-4p1c2gms-4p2c3gms-4p3c4gms-4p410.8015.5410.1611.9416.869.0014.3111.6113.3615.4110.8014.619.4815.3615.1510.2014.82 *10.4213.55 *15.81 *185注：*显著差异水平 5%，*显著差异水平 1%。2.6杂交组合品质分析每个小区随机采集样本（叶片），三次重复，采用化学方法进行成分分析。方差分析结 果表明，处理间达到极显著差异水平。乌塌菜各杂交组合营养成分整体处于较高水平，但是 某些成分含量低于对照。在四个杂交组合中，c1 组合表现较为突出，蛋白含量，维生素 c 含量显著高于对照水平，可溶性糖含量显著高于其他组合但低于对照水平，有机酸含量和粗 纤维含量显著低于对照水平，而且微量元素含量也处于较高水平。表 11 乌塌菜杂交组合成分分析tab 11. components analysis of hybrid combinations in wutacaisoluble sugar（g/100g）protei n mg/10gvc mg/100g201.37organ ic acids%mg/100gmg/100gmg/100gmg/100gmg/100g21.2515.3160.54210.6120.16520.9206.2310.29110.8240.144*18.8285.4460.33110.4980.370*15.9134.5480.27510.670*0.11513.4096.5100.37911.0760.320*crude kfiber%p feca znck 1.756 3.4933.660c1 1.761*c2 1.570 3.4643.591c3 1.750*c4 1.545 3.4243229.342*186.117198.830191.2030.328 4.7980.194 4.0965.916*0.176*0.145 3.9145.4400.254*190注：*显著差异水平 5%，*显著差异水平 1%。3结论不育性稳定且完全不育的不育系非常适合于十字花科蔬菜的育种，而且潜在的杂种优势 已有报道6。对于具有这些特性的复等位基因雄性不育系的育种研究工作已经被实施，并且195200205210215220225230235240几乎在所有的大白菜生态型中获得成功16-19。这类不育性也适用于其他的芸薹属亚种蔬菜作 物，包括小白菜20-23（b. campestris l. ssp. chinensis），中国菜心25（b. campestris ssp. parachinensis），和紫菜薹等25（b. campestris ssp. chinensis var. purpurea hort.）。然而具有 完全不育性且植物学性状与目标亲本相似的乌塌薹不育系至今未见报道。在本研究中，按照 “定向转育计划”，奶白菜复等位雄性不育基因被成功的转入乌塌菜中。获得了具有 100%不 育度和 100%不育株率的乌塌菜核复等位基因雄性不育系 gms-4。定向转育是乌塌菜雄性不育系转育过程中的关键。因为乌塌菜不育系本身相当于杂交 种，再配制杂交组合相当于三交种，为了保证整齐度，在转育不育基因的同时要兼顾植物学 性状和经济性状的转育26。按照“定向转育计划”，在连续的回交之后， “两用系”和“保持系” 相当于姊妹系，与目标品系具有相似的植物学性状。因为具有相似的遗传背景，由此系统育 成的雄性不育系的遗传特性非常稳定。进一步讲，由此不育系配成的杂交种具有较高整齐度。一个具有高品质且具有与目标品系植物学性状相近的不育源材料是转育优良不育系的 前提。本研究也选择了一个芸薹属亚种蔬菜，奶白菜为雄性不育源。奶白菜具有叶色浓绿， 叶片褶皱有光泽，味道鲜美，营养丰富等特点。由于不育源与目标品系之间具有许多相似之 处，使得转育进程大大加快。回交世代的选择对于定向转育的影响也十分重要。回交代数不足，达不到定向转育效果，回交代数过多，易造成自交衰退现象。因此在定向转育进程中，回交代数应当由回交群体与 目标品系的相似度来确定。本实验中，经过 4 次回交转育成的不育系 gms-4，在植物学性 状上与 wt01 近乎一致，且没有任何衰退现象。对于乌塌菜定向转育不育系而言，回交 4 次是一个合适的选择。以 gms-4 为母本生产的杂交组合表现出显著的杂种优势，而且杂交组合的营养成分含 量也达到商业生产所需水平。一些杂交组合间产量达到了极显著差异水平。c4 产量最高， 随后依次是 c1,c3,c2。与对照相比较，由高到低顺序依次增产 54.9%，45.3%，32.8%和 2.2%。 类似的产量杂种优势在其他芸薹属作物中也有报道27-29。由不育系配成的杂交组合的营养成 分含量高于常规品种的平均水平3, 30-31。成分分析实验结果显示在各处理间均达到极显著差 异水平。c1 组合大部分营养成分含量极显著高于对照，有机酸含量和粗纤维含量低于对照 说明其口感更好。因此，综合考虑产量和品质因素，选出一个最优组合 c1。参考文献 (references)1 李署轩.中国蔬菜百科全书(蔬菜卷)m.北京：农业出版社，1990. 2 李振英. 稀有蔬菜栽培技术m. 北京：科学技术出版社，2000.3 舒英杰，周玉丽. 中国乌塌菜研究j. 安徽师范学院学报，2005，19(3)：15-18.4 谭兴，王玉刚. 菜薹和乌塌菜核不育位点基因频率j. 沈阳农业大学学报，2008，39(2)：348-350.5 havey m j. the use of cytoplasmic male sterility for hybrid 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