乙型肝炎的生物治疗研究.doc

乙型肝炎的生物治疗研究堡堂壁蔓鐾笙箜鲞箜!塑:24.!坠壁!垦!ra壁口763综述与讲座|8l:|l.|:j|.*:.:|乙型肝炎的生物治疗研究张才军曹婉恒王玲1昆明医学院微生物学与免疫学教研室,云南省昆明市650500;2查普曼大学食品科学教研室关键词乙型肝炎免疫治疗细胞因子疫苗中图分类号:r512.62文献标识码:a文章编号:10017585(2011)07076304全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(hbv).由于ftbv缓慢的病毒清除动力学和自发的基因变异性,慢性乙型肝炎的抗病毒治疗在临床上仍然是一种挑战.抗病毒治疗基本分两大类:免疫治疗与核苷类似物治疗.每一种抗病毒药物都有其内在的局限性.广谱抗病毒药物和调节机体免疫功能的药物同时治疗较好,拉米呋啶,araa,a干扰素对乙型肝炎有一定疗效.现将乙型肝炎的生物治疗研究进展综述如下.1过继免疫治疗过继免疫治疗(adoptiveimmunotherapy)是将体外激活的免疫活性细胞或细胞因子进行免疫性转移,输注给肿瘤或感染病毒的宿主,使其在体内产生协同作用,由免疫活性细胞杀伤,溶解肿瘤或病毒感染的细胞,直接或问接地介导机体的抗肿瘤或抗病毒效应.1.1骨髓移植(bmi,)疗法既往临床观察表明,一些合并hbv感染的血液病患者接受抗一hbs阳性供者骨髓后,在造血和免疫功能重建的同时,其体内的hbv也被清除.chen等口报告了43例接受bmt的hbv感染者,其中32例接受异基因bmt,11例接受自体bmt,随访1l1年,接受异基因bmt的患者有26例发生肝功能损害,5例发展为暴发型肝炎;在接受自体bmt的患者有4例发生肝功能损害,无1例发生暴发型肝炎,提示自身移植的安全性较高.1.2肝移植过继免疫u等l_2对28只小鼠实施原位肝移植,对21只小鼠实施骨髓移植作为对照,供体小鼠均为乙肝表面抗原疫苗注射后并出现抗一hbs阳性,结果接受肝移植的小鼠有23只出现了抗一hbs,并持续了29周,而接受骨髓移植的21只小鼠有19只出现了抗一hbs,并持续了212周.据dahmen报道:对34只小鼠实施原位肝移植,供体为抗一hbs小鼠,结果29只出现了抗一hbs并持续了210周,且受体和供体最大滴度无明显差异.1.3造血干细胞移植由于hbv不仅能感染患者的骨髓基质细胞,而且还感染患者的外周血淋巴细胞,且骨髓移植风险较高,因此,有研究者将目光投向了造血干细胞.ilan观察了12例接受hbsag阳性供者的造血干细胞移植的患者,其中hbsag阳性8例,阴性4例,随访13.2个月,8例hbsag阳性患者中有1例死于肝衰竭,1例alt升高,4例阴性患者无1例发生hbv感染.因此认为,造血干细胞移植可能会减少hbv感染.1.4lak细胞疗法淋巴因子激活的杀伤细胞即iak细胞1987年开始用于慢性乙肝的治疗.治疗经验发现:临床上有反复轻度肝功能受损,alt轻度升高,hbeag阳性或hbv-dna阳性,但滴度较低的患者效果较佳,其hbeag阴转率近期为449/6,远期为58;dna阴转率则分别为57f,和7o.应用iak细胞治疗效果,受个体免疫状态的影响,免疫低下者效果差.由于lak细胞治疗中需要使用大量il一2,而il-2可引起毛细血管渗透性增加综合征等不良反应,目前研究的方向是寻找更有效的lak前体细胞,改善lak细胞诱导方法,改变lak细胞的输注途径等以期望减轻其治疗的副作用.1.5树突状细胞(dendriticcells,dcs)疗法i)c激活的细胞免疫,特别是ctl介导的免疫反应,通过杀伤感染的肝细胞和释放抗病毒的细胞因子来清除hbv.尽管血中存在高浓度的病毒抗原,慢性乙肝患者没有启动有效的免疫反应,作为起核心作用的dc可能与慢性乙肝患者对病毒抗原的这种弱反应有关.现已有研究表明包括hbv在内的多种病毒感染中,均存在抗原递呈功能缺陷,而这种减弱的抗原呈递功能可通过肿瘤抗原致敏增强.hasebe等4通过用hbv转基因鼠模型研究hbv感染后机体免疫耐受状态与dc等免疫细胞功能的关系,发现这种状态并不是因为淋巴细胞功能缺陷,而是由于抗原递呈功能缺陷,特别是dc功能缺陷764口竺壁!竺竺!垦ra壁vo21:!ap蔓2o11011午箜24卷筮!论颦墼墼引起.yan等研究经过干扰素治疗的慢性乙肝患者体内dc亚类数量变化,发现对干扰素治疗有效果的患者体内dc特别是髓系i)c明显升高,也间接证明了dc在乙肝病毒清除中的关键作用.因此,诱导成熟的dc细胞进行免疫过继治疗,可能会取得对慢性乙肝患者重建细胞免疫的作用.1.6cik细胞疗法cik细胞全称为多种细胞因子诱导的杀伤细胞,1991年美国斯坦福大学医学院骨髓移植中心首先报道了这种高增殖力和高细胞毒性并由细胞因子激活的杀伤细胞的培养方法.随着体外大量增殖cik细胞方法建立,在全世界范围内引起了普遍的关注,国内外很多学者对其细胞来源,免疫学特性,抗病毒,抗肿瘤的杀伤效能都做了深入的研究和阐述.由于cik细胞具有非mhc限制性,高增殖活性,高细胞毒力,细胞来源丰富等优点,目前已经开始试用于治疗慢性乙型肝炎.gao等l_6j对16例慢性乙肝患者用cik治疗52周,取得较好效果,完成治疗的14例患者中,dna转阴,hbeag/antihbe血清转换及肝功能恢复正常的各42.869/6.但cik细胞用于临床治疗慢性乙型肝炎的经验和报道仍然很少,其清除病毒的机制和效果尚需更多的研究来阐明.2细胞因子治疗2.1a干扰素(interfron-a,ifna)_7jifn仍然是目前慢性乙型肝炎治疗中抗病毒的首选药物.据抗原性不同,将ifn分为(it,j3和三类,抗病毒的主要药物是ifna.干扰素通过与靶细胞受体结合,诱生多种抗病毒蛋白,阻碍病毒核酸和蛋白质合成,从而抑制病毒复制,干扰素具有重要的免疫调节作用.hbv在机体内持续感染与th1/th2失衡密切相关,慢性hbv感染者以th2细胞应答占优势.ifn一0t治疗后患者1l2,i12,sil_2r水平上升,而il-6水平下降,使动态平衡倾向于thl,利于hbv的清除.2.2白细胞介素12(interleukin-12,i12)0ii,12是由抗原呈递细胞产生的一种异双聚体细胞因子,可促进thl细胞发育,介导细胞毒活性和ifn一丫的产生,诱导t细胞和nk细胞分泌ifn一7.il_12是重要的抗hbv细胞因子,可抑制hbv复制,对慢性乙型肝炎患者有较明显的抗hbv-dna活性,11.-12的效应和剂量相关,且在一定剂量范围内是安全和可耐受的.熊仕秋等【_9研究显示,il-12体外能增强慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞产生ifn_丫,从而上调细胞免疫应答,以利于hbv从体内排除.3治疗性疫苗慢陛乙型肝炎的现行治疗主要依靠核苷(酸)类似物及干扰素,其存在高耐药,低耐受及不良反应等问题.治疗性疫苗通过调节人体免疫应答达到治疗疾病的目的,其在以下情况下尤具价值:(1)无针对病原或疾病的有效治疗,抗生素和/或抗病毒药物不能清除致病原,易产生抗药性,或由于药物不良反应不能长期接受药物治疗者;(2)在感染的自然进程中,机体自身能产生一定的自体免疫,如某些hbv及人乳头状瘤病毒感染者,体内病毒可以被清除;(3)在感染导致的慢性炎症或恶性转化等严重危及生命的症侯出现前,存在着慢性携带阶段.针对慢性乙型肝炎的治疗性疫苗的研究目标是通过主动免疫改变机体的免疫应答,打破慢性感染者对hbv的免疫耐受,重建或增强免疫应答.3.1蛋白类疫苗目前在研究的多数蛋白类乙型肝炎治疗性疫苗均来源于预防性乙型肝炎疫苗,其由携带表面抗原,直径为22nm的空病毒颗粒构成,包括13个由酵母或其他真核细胞生产的hbv包膜蛋白.这些疫苗含有氢氧化铝佐剂,能诱导th2型免疫反应,增强抗一hbs的分泌.研究表明,该类疫苗可能对部分慢性乙型肝炎患者产生特异但短暂的抑制病毒复制作用.2o世纪8o年代,我国科学家闻玉梅等对乙型肝炎患者的研究发现,我国9o以上的乙型肝炎患者肝细胞并无病毒基因整合,患者对hbsag的耐受为我国乙型肝炎发生慢性化的主要机理,并据此提出组建新抗原,改变耐受原的提呈方式,构建乙型肝炎治疗性疫苗以消除机体对hbsag的免疫耐受,达到治疗乙型肝炎的目的.其后,开始了为期10年的建立鸭乙型肝炎免疫耐受动物模型及消除免疫耐受对策的研究,终于在鸭动物模型中发现以抗原抗体复合物(ic)作为治疗性疫苗能获得较好疗效ll.该疫苗自2003年开展临床研究以来,至今已成功进行了i,及期研究,结果表明,该疫苗安全性好,在患者体内能诱导有效的hbeag血清转换,并降低病毒载量.3.2肽类疫苗国内有学者以hbcag1827表位为基础,分别引入th细胞表位thl,th2及b细胞表位b1,b2构建了治疗用hbv模拟抗原.以该模拟抗原免疫balb/c(h-2d)d鼠,能诱导抗原特异性效应ctl,同时外周血单核细胞中ifn_7分泌细胞显着增生.而模拟抗原体外刺激慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞能有效诱导单核细胞产生抗原特异性ctl反应1引.该治疗性疫苗已完成工及.期临床研究.,堡堂堡壁墅堑墅生箜鲞箜!塑!:!:!垒巳!皇!垒壁!垦!堕!口7653.3dna疫苗dna疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗.克隆特定病原特异性基因且含有强有力真核细胞启动子的细菌质粒,注射人人体后,可在体内表达抗原.表达的蛋白经处理后,通过mhci与mhcii两条通道提呈给免疫系统,刺激机体产生特异性体液和细胞免疫反应.已有研究概括出dna疫苗的特征:(1)可以同时诱导细胞及体液免疫;(2)不同免疫途径均可诱发免疫反应;(3)具有适当结构及组成的外源性基因可以在人体内表达,并诱生中和性抗体n.由于其可能的治疗效果,dna疫苗问世不久即被引入慢性乙型肝炎的治疗研究中.法国pasteur研究所davis等将巨细胞病毒启动子及hbvs基因克隆到质粒中,构建了pcmv-hbs.小鼠肌肉注射loop.gpcmv-hbs,基因转染后10d即可从血液中检测到hbsag;15d后,抗一hbs出现并持续上升;注射后2周,91小鼠抗体阳转;注射后8周,100发生抗体阳转.随后,该研究组采用含有s及pre-s2基因的pcmv-s2.s免疫hbv转基因鼠,发现免疫l剂后,小鼠体内循环hbv即可被清除,并产生抗一hbs,小鼠肝细胞病毒表达量得以有效控制.3.4自体dc疫苗dc在外周摄取及处理抗原,表达淋巴细胞共刺激分子,然后移行到淋巴器官,并分泌细胞因子,激活ctl及th,启动并调节抗原特异性免疫应答.因而,dc扮演着启动者与调控者的双重角色.而在持续感染的状态下,dc无法识别内源性抗原,无法完成抗原摄取及提呈功能,因而不能启动抗原特异性免疫应答.随着体外培养扩增ix;方法的成熟,利用dc突出的抗原提呈能力,通过体外与hbsag共孵育致敏,负载hbv相关抗原.不管内源性dc如何,致敏的ix;可以直接诱导hbsag特异性免疫应答,进而打破免疫耐受,有效清除机体内hbv,此即dc疫苗治疗慢性乙型肝炎的机制m.李用国等在体外将致敏的dc与单核细胞共孵育,诱导hbsag特异性ctl,然后攻击能表达hbsag的靶细胞模型hepg2/s,结果表明,致敏dc激活的hbsag特异性ctl对靶细胞模型hepg2/s具有较强的杀伤效应.同时,他们还针对19例hbeag阳性慢性乙型肝炎患者进行了研究,所有患者均给予2剂13(3疫苗,间隔2周,治疗结束后进行1年疗效随访.至研究结束时,10例患者hbeag消失;5例获得了hbeag血清转换;2例hbvdna水平降至检测水平以下,但未见hbsag血清转换.4免疫调节剂治疗胸腺肽al(thymosinal,tm)是人工合成的一种多肽物质,生物活性比动物胸腺提取物更高.tal可促进t淋巴细胞在胸腺内增生及成熟,增加淋巴细胞分泌il-2,a及7干扰素,增强il-2受体的表达作用.此外,tal可增强nk细胞的数量和活性,通过对辅助t细胞,细胞毒淋巴细胞及nk细胞等免疫细胞的增殖作用,间接地杀死受病毒感染的肝细胞及肿瘤细胞.目前,tal作为免疫增强剂被广泛应用于重度感染,肝炎和肿瘤的免疫治疗;国内外学者应用tal治疗重型肝炎也取得了较好的疗效,资料显示,加用tal治疗重型肝炎1个月后,患者alt,tbil下降,ptv,a,che及临床有效率等增加都较对照组差异有显着性,提示ta1作为强大的双向免疫调节剂,对改善患者的临床症状及恢复肝功能等有明显的疗效,且应用ta1者hbv_dna转阴及滴度下降也与对照组比较差异有显着性,提示ta1有一定的抗病毒作用1引.新加坡lim等eat3的研究还显示tal与干扰素联用可以增强其抗病毒作用,达到优势互补效果.5展望随着慢性乙型肝炎患者体内的天然免疫和特异性免疫功能损伤机制研究的深入,对肝脏耐受相关机制的阐明,将有助于发展更新更好的免疫学治疗方法,与抗病毒药物的联合应用将提高慢性乙型肝炎的i临床疗效.过继免疫疗法可借助正常个体的免疫功能来协助或纠正有免疫功能障碍的患者,故在慢性乙肝治疗上有较好的应用前景.细胞因子的治疗有一定进展,但疗效有待进一步研究.新的,更为安全且有效的治疗药物及途径亟待发展,目前尚未有疫苗进入注册阶段,但治疗性疫苗极具开发前景,是当前国内外乙型肝炎治疗的研究热点.总之,乙型肝炎生物治疗的研究任重道远.参考文献el-ichenpm,choutj,fanfs,eta1.fulminanthepatitisissignificantlyincreasedinhepatitisbcardersafterallogeneiebonemarrowtransplantationcj3.transplantation,1999,67:14251433.23lij,dahmenu,dirschor,eta1.thepotentialroleofbonemarrowtransplantationinaugmentingdonor-derivedimmunitytohepatitisbafterratlivertransplantationj.livertranspl,2002,8:397-404.3duanxz,zhuangh,wangm,eta1.decreasednumbersandimpairedfunctionofcirculatingdendriticeellsubsetsinpatientswithchronichepatitisbinfection(r2)j.jgastroen-terolhepato1,2005,20:234242.766r_jmedtheor教pracvo1.24,no.7,apr20112011年第24卷第7期黼至璺酲薯萑兰譬葚爨麟43hasebea,akbarsm,furukawas,eta1.impairedfunctionalcapacitiesofliverdendriticcellsfrommurinehepatitisbvirus(hbv)carriers:relevancetolowhbv-specificimmuneresponses(j.clinexpimmunol,2005,139:3542.5yant,wanghf,jiw,eta1.clinicalprofilesofcirculatingdendriticcellsubsetsinchronicallyhbv-infectedpatientswithinterferon-alphatreatmentj).zhonghuayixuezazhi,2005,85:1177-1181.6gaoy,weil,chenhs,eta1.autologousadoptiveimmunotherapywithoutdestructionofinfectedcellsduringthetreatmentofchronichepatitisbj.zhonghuaganzangbingzazhi,2003,11:391-393.7刑同京,徐洪涛,主编.肝脏免疫学m.北京:科学技术文献出版社,2010:1l1.83王吉耀,主编.现代肝病诊断与治疗m.上海:复旦大学出版社,2007:1518,27.9熊仕秋,刘惠平,高翔,等.il-12体外促进慢性乙型肝炎患者pbmc的ifn-7的产生(j3.中国免疫学杂志,2006,22(5):473-476,479.1oautranb,carcelaing,combadiereb,eta1.therapeuticvaccinesforchronicinfectionsj.science,2004,305(5681):205208.11wenym.antigenantibodyimmunogeniccomplex:promising(上接第757页)癌细胞同步处在g1/s期,能抑制放疗损伤细胞的修复能力,使乏氧细胞再氧合,增加癌组织的放射效应.在本研究中,顺铂组和顺铂联合紫杉醇组的近期疗效分别达到95.o和97.5,而单纯放疗组则为67.5,与前两组相比有显着性差异(p<0.05),在远期疗效方面,顺铂组和顺铂联合紫杉醇组的三年生存率分别为72.5和77.5,单纯放疗组则为50.0.局部复发率单放组为20.09/6,顺铂组和顺铂联合紫杉醇组分别为7.5和7.59/5,远处转移单放组为22.59/6,顺铂组和顺铂联合紫杉醇组分别为10.0和7.5%00,单纯放疗组与同步放化疗的两组相比均有显着性差异(p<0.05),均有显着性差异,因此笔者认为同步放化疗能明显提高中晚期宫颈癌的疗效.但在毒副反应方面,本研究发现顺铂组和顺铂联合紫杉醇组的骨髓抑制和胃肠道反应明显高于单纯放疗组,这与刘少兵等5报道相仿.因此,在同步放化疗时笔者同时做了积极处理,放化疗期间用阿扎司琼止吐,监测血常规,用吉粒芬生白治疗,积极复查血常规,经过对症治疗后,患者均能继续治疗.顺铂联合紫杉醇组的骨髓抑制和胃肠道反应较顺铂组高,两者相比无显着性差异,但由于样本数有novelvaccinesformicrobialpersistentinfectionsj3.expertopinbiolther,2009,9(3):285291.12周芙蓉,王晴,贾正才,等.治疗用hbv模拟抗原的设计及其诱导慢性乙型肝炎患者外周血ctl活性研究j.免疫学杂志,2003,19(4):254-257.13srivastavai,lium,ulmerj.dnavaccines(m3.in:levinem,kaperj,appuolir,etal,editors.newgenerationvaccines.3rded.newyork:marceldekker,inc,2004:367-380.14汪萱怡.乙型肝炎治疗性疫苗研究进展j.世界临床药物,2009,30(6):321327.15李用国,罗云萍,兰英华,等.树突状细胞hbsag疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的