乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形.doc

乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形2009年9月第46卷第5期四川大学(自然科学版)journalofsichuanuniversity(naturalscienceedition)sep.2009vo1.46no.5doi:103969/j.issn.04906756.2009.05.52乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形邓娅琦,黄熠,李正,黄林,姚少华,杨寒朔,胡火珍(1.四川大学生命科学学院医学细胞生物学教研室,成都610041;2.四川大学生命科学学院华西医学院华西医院肿瘤生物治疗国家重点实验室,成都610041)摘要:为了研究hbx对胚胎发育的影响,从含有hbx基因的质粒上转录hbxmrna,显微注射入斑马鱼早期胚胎,在bud期进行表型观察,并用全胚胎原位杂交法检测hbx对斑马鱼胚胎早期发育的影响,用脊索标记基因ntl和骨骼肌标记基因myod作为探针检测胚胎发育背部化的特征袁型.发现hbx基因的表达引起斑马鱼胚胎早期发育背部化畸形,hbx基因过量表达的胚胎背部化表型与早期胚胎wnt缺失表达导致的胚胎发育背部化表型一致,hbx可能通过激活wnt/fl-catenin信号通路的表达和调控,造成胚胎发育背部化的畸形.关键词:乙肝病毒x基因;显微注射;斑马鱼;背部化中图分类号:q344文献标识码:a文章编号:04906756(2009)05148805hbxexpressioninciducesthedorsalizationofzebrafishembryodengyaqi,huangyi,lizheng,huanglin,nghanshuo.,ya0shaoh口,h己厂hiaozhen(1.themedicine-biologylaboratoryofcollegeoflifesciences,sichuanuniversity,chengdu610041,china;2.statekeylaboratoryofbiotherapyandcancercenter,westchinahospital,westchinamedicalschool,collegeoflifesciences,sichuanuniversity,chengdu610041,china)abstract:toinvestigatetheeffectsofhbxinzebrafishembryoearlydevelopment.hbxmrnawastranscript,andmicroinjectedintheearlyembryoofzebrafish.phenotypeswereobservedatthebudstageoftheprocessofthezebrafishembryodevelopment,anddetctedbywhole-mountinsituhybridizationbynotochordmarkergenentlandskeleta1musclemarkergenemyodasprobs.itwasfoundthathbxexpressioninciducedthedorsalizationofinzebrafishembryo,andthephynotypesofthedorsalizationweresimilertothatofthepynotypesbyknockdowntheexpressionofwntduringearlyembryodevelopment.hbxcouldprossiblyinducethedorsaliztionofthezebrafishembryointheearlydevelopmentbyactingthewnt/fl-cateninsignalpathway.keywords:hepatitisbvirus(hbv),microinjection,zebrafish,dorsalization1引言肝癌(hepatocettutarcarcinoma,hcc)是世界上最致命的恶性肿瘤之一,每年有超过500万的新患者被确诊,世界平均发病率是每100万人中有5.5-9.9人,导致每年6o100万人死亡卜.肝癌的一个重要的病原体是乙型肝炎病毒,hbv导致肝脏慢性病发展成为肝癌的几率增加近一百收稿日期:20080401作者简介:邓娅琦,(1982一),女,四川省德阳市人,硕士研究生,研究方向:细胞生物学,email:通讯作者:胡火珍.email:第5期邓娅琦等:乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形1489倍is.在9o的肝癌肿瘤中检测到了hbv的dna5.因此,肝癌的发生与感染hbv有直接关系.hbv的传播有两种方式:平行传播和垂直传播.垂直传播指的是通过生殖细胞或宫内传播而使子代感染乙肝病毒.经过流行病学调查统计,垂直传播感染占了近5o7.有报道称,即便对感染了hbv病毒的母亲通过延长拉米夫定治疗法将其hbvdna抑制至低水平,并对其小孩进行了新生期接种和高浓度的antihbs治疗,仍然在二者体内检测到了完全同源和具有相似阿卡波糖突变的hbvdna8.同时,精子和卵子携带的hbvdna已被证明可在小鼠早期胚胎中复制和表达嘲.hbv基因组包括4个读码框,分别是s,c,p和x.x基因是最小的读码框,长约462bp,编码的hbx蛋白长154个氨基酸的多肽,在hcc的致病机理中起关键作用.hbx蛋白作为一个反式作用因子,可同时激活宿主和病毒基因,间接导致肝癌形成1.hbx可与细胞中多种蛋白相互作用激活多种癌基因和细胞周期基因,导致细胞调亡或抑制细胞调亡.但是hbx基因的功能仍然不清楚.到目前为止,有多个实验室通过转基因小鼠或注射小鼠的方式研究hbx基因在活体内的功能,但是hbx基因是否会影响胚胎发育,迄今未见报道.斑马鱼产卵量大,一对成鱼每周可产卵200400枚;胚胎体外发育并且完全透明,可以适时,动态监测体内细胞生物学行为及器官形成;性成熟期早,1o12周即可到性成熟期;具有大部分与哺乳动物相匹配的细胞,组织和器官;它的全基因组测序工作已经完成,具有与人类高度保守的发育信号传导路径.因此,我们选择斑马鱼作为新的动物模型,研究hbx基因对胚胎发育的影响及hbx基因的功能.2材料和方法2.1材料质粒:连接hbx基因的pcdna3.1为本室保存.斑马鱼品系:野生型.限制性内切酶来自promega公司;质粒抽提试剂盒,来自invitrogen公司,胶回收纯化试剂盒来自promega公司;mrna转录试剂盒t来自ambion公司;显微注射仪:apparatuspl190.2.2方法2.2.1hbxmrna的转录按照ambion公司t7转录试剂盒的说明书进行.模板的准备:按照invitrogin小抽试剂盒说明书抽提连接有hbx基因的pcdna3.1质粒,hind酶切2h,用rnasefree的胶回收试剂盒回收.2.2.2hbxmrna的显微注射用apparatuspl1-90显微注射仪可保持定量注射,注射量40pg/egg.注射时间:1细胞期.注射后置于holtfreter溶液,28孵育.2.2.3全胚胎原位杂交按照常规原位杂交方法进行.胚胎注射后,置于holtfreter溶液,28孵育,bud期(10hpf)时用5多聚甲醛固定过夜.探针:myod,nt1.3结果3.1hbxmrna的转录凝胶电泳检测转录片段的长度,hbxmrna长462bp.bpm3()0lo2o()ol)50o4oo图1mrna转录的电泳图fig.1themrnaofhbxis462bpasshown3.2hbxmrna对斑马鱼早期胚胎的显微注射在bud期(10hpf),注射组胚胎体轴拉长,尾部变窄,呈略上狂狭窄的椭圆形(图2,a和b).未注射的对照组胚胎呈圆形(图2c和d).当胚胎发育至24h注射组背部化表型更加明显,根据表型的严重程度分为三个梯度:表型+:头部略微变小,尾末端向内弯曲(图3a);表型+:头部明显变小或不发育,尾缩短并向内弯曲或不发育(图3b);表型+:整个胚胎发育严重障碍,头尾不发育,只有部分躯干组织(图3c).对照组尾部呈1490四川大学学4gl(自然科学版)第46卷直线型(图3d).在190个注射胚胎中,共有142个胚胎出现上述表型,分别为96,36,1o个,占总数的75(图3).一一一一图2显微注射hbxmrna,bud期表型观察a和b:注射组;c和d:对照组fig.2phenotypesatbudstagea,b:hbxoverexpressedembryoswereovoidshapedwithextendingaixsandnarrowtailside;c,d:controlembryoswithnormalroundshape一|赫ii毫每誊l善鼍誊曩毫萎|誊图3显微注射hbxmrna,24h袁型观察a,b,和c:注射组;d:对照组fig.3phenotypesofthehbxmrnainjectedembryosat24hpfa:phenotype+embryos,thetailwascurlinglightly,b:phenotype+embryos.brainwassmallandtailwasshortandcurledoverthetrunk(thelowerrow),oradheredtotheembryowithoutyolkextension(theuprow),c:phenotype+embryos.hebrain.thetrunkandthetailalmostcannotbedistinguishedbuttheyolkwasintegrated,d:thecontrolembryoswithoutinjection正常+死亡图4胚胎表型率统计fig.4statisticsofinjectedembryoseachoftotal190embryoswasinjected40pghbxmrnaatonecellstageandincubatedinholtfreerssolutionat28.5cfor24hpftobeobserved3.3全胚胎原位杂交鉴定注射胚胎背部化当注射胚胎发育至bud期时,用5%多聚甲醛固定过夜,用于原位杂交.选用的探针为:ntl和myod.ntl是背部标记基因,在和胚胎早期背部中图5bud期原位杂交a:对照组,ntl;b:注射组,ntl;c:对照组.myod;d:注射组,myodfig.5who1eembryohybridization,showingtheexpressionsofntl,andmyodinwholeembryosatthebudstagea:controlembryowithoutinjectionhybridizatedbyntlprobe,thedarktrailshowedthenotochord,b:hbxmrnainjectedembryohybridizatedbyntlprobe,thenotochordincreasedinwidth,c:controlembryowithoutinjectionhybridizatedbymyodprobe,thenarrowpathbetweenthetwodarkrowsshowedthelocalizationandshapeofthenotochord,d:hbxmrnainjectedembryohybridizatedbymyodprobe,thenotochordincreasedinwidth踯o卿基杂第5期邓娅琦等:乙肝病毒hbx基因诱导斑马鱼胚胎发育背部化畸形1491轴将来发育为脊索的细胞中持续表达,促进脊索的分化1.对照组正常的胚胎中,前脊索细胞在背部中轴排列成一条细线(图5a),而注射组背部中轴将来发前脊索细胞组成的线条明显变宽(图5b);myod是骨骼肌细胞的标记基因,在胚胎发育早期,从midgastrula期开始直至体节形成之前,在紧贴脊索两侧的界限近轴细胞(termedadaxialcells)中表达,细胞沿着脊索的位置排列成两条线1.(图5c),注射组胚胎中,两条线的位置比对照组宽,也显示了中间脊索的变宽(图5d)尾部变长和脊索变宽,都是胚胎发育的背部化的典型表型.4讨论肝炎病毒感染是一个世界性的健康难题,我国也是肝炎病毒的感染大国,目前对于肝炎病毒传染途径的研究重心主要是在母婴传递的领域.大多数感染区的少儿乙肝病毒传染病例中,通过母婴传递占了近5o.然而,在目前的以小鼠作为动物模型的相关实验中,未见报道hbx是否会影响胚胎的早期发育,大多数的研究重点是放在病毒基因在母婴传递过程中在胚胎中的复制转录和表达的检测与治疗等,对于病毒基因是否影响胚胎的正常发育可能有所忽略.我们采用了新的动物模型:斑马鱼胚胎模型,其胚胎的透明度高,繁殖力强,发育周期短等特点,比小鼠更适合作为研究胚胎发育的模型,更容易直接观察到肝炎病毒影响胚胎发育产生的表型和进一步的机制研究.我们通过体外合成hbx基因的mrna,显微注射人斑马鱼受精卵的方式,模拟hbv垂直传播,在活体中初步研究了hbx基因对胚胎发育的影响.首先,显微注射hbx基因的mrna,斑马鱼发育出现异常,表现为胚胎外包变得缓慢,24hpf出现尾部变细或卷曲,缺少腹鳍;其次,我们通过整胚原位杂交显示ntl和myod,显示出胚胎中脊柱变宽,脊柱发育差等背部化的表型.而这些表型现象跟wnt缺失导致的胚胎背部化表型一致,提示可能与wnt缺失表达有关.在斑马鱼的早期胚胎发育过程中,wnt/fl-catenin信号通路对背部体轴的形成起着重要的作用,调控背部发育的稳定性和位置n.wnt信号还参与大脑的形成,参与脊椎动物的肢体起始和顶端外胚层脊的形成.在wnt/catenin信号通路中,wnt通过激活级联反应解离由axin,gsk3,cki,apc,和catenin组成的蛋白质复合物,使游离的未磷酸化的catenin增多,游离的未磷酸化的catenin可进人细胞核激活胚胎背部化调控基因的转录l1在我们的实验中,因hbxmrna进入斑马鱼受精卵,有可能影响斑马鱼早期胚胎细胞中与wnt相关的信号通路而导致了斑马鱼胚胎背部化畸形.有研究表明,hbx可以通过抑制gsk3的活性而激活hbv感染的肝细胞的wnt/fl-catenin通路1致肝细胞癌变.所以,通过本实验也可以理解hbx导致胚胎发育异常,细胞癌变,可能具有相似的机制.本研究利用斑马鱼这一优秀的胚胎发育模式生物,第一次发现了hbx能够引起胚胎早期发育的畸形.我国人口的肝炎病毒感染率很高,hbv可以经过被感染的母亲传递给婴儿,hbv是否会对婴儿的胚胎早期发育也造成一定的影响,高出生婴儿死亡率是否也与hbv导致胚胎畸形以致死亡有关,有待进一步的动物实验确定hbx对这一致畸作用的分子机制和临床病理统计.参考文献:1-iparkindm,brayfi,devesass.cancerburdenintheyear2000.theglobalpicturej33.europeanjournalofcancer,2001,39(6):848.2-1josepml,andrewb,jordib.hepatocellularcarcinomaj.thelancet,2003,362(9399):1907.3boschfx,ribesj,c16riesr,eta1.epidemiologyofhepatoce1lu1arj.clinicsinliverdisease,2005,9(2):191.4-1beasleyrp,hwangly,lincc.hepatocellularcarcinomaandhepatitisbvirus:aprospectivestudyof22707menintaiwanej3.thelancet,1981,138(8256):1129.5kochs,loringhovenaf,hofschneiderph,eta1.amplificationandrearrangementinhepatomacel1dnaassociatedwithintegratedhepatitisbvirusdnai-j.emboj,1984,7(3):2185.6tokinot,fukushiges,nanamurat,eta1.chromosoma1translocationandinvertedduplicationassociatedwithintegratedhepatitisbvirusinhepatocellularcarcinomasj.virol,1987,61(12):3848.733changmh.hepatitisbvirusinfectionj.seminarsinfeta1andneonata1edicine,2007,12(3):160.i-8-1syedn,salmam,luqmanak,eta1.verticaltransmissionofhepatitisbvirusdespi