产紫杉醇内生真菌的初步筛选.doc

豆丁网精品论文产紫杉醇内生真菌的初步筛选严铸云，郭晓恒，罗静，曾庆秋 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） e-mail：摘要：目的：获得产紫杉醇的内生真菌。方法：采用平板稀释法分离，经过发酵、萃取， 产物经 tlc 及 hplc 鉴别。 结果：发现 3 株含有紫杉醇或其结构类似物。结论：从四川省采得的中国红豆杉（taxus chinensis）内分离得到 77 株真菌，经过初步筛选发现三株内生菌。经过初步鉴定分别为小月孢属(selenosporella arnaud)、曲霉属(aspergillus link)和木霉属(trichoderma pers)菌。特别是曲霉属的米曲霉（aspergillus oryzae）产量约为 50g/l，值得 进一步研究。关键词:紫杉醇；内生真菌；发酵；c紫杉醇（pacitaxel 商品名taxel）是继阿霉素、顺铂之后最有前途的抗癌药物，它是以 a，b，c和d四个环为核心骨架组成的二萜类化合物，是一种高效的细胞毒素。1979 年， s. b.horwitl等人报道了紫杉醇的作用机理，认为它是同细胞中的微管蛋白结合并将其稳定 和冻结，以阻止微管蛋白解聚的方式使癌细胞停止分裂，直至死亡。目前紫杉醇主要来源于 红豆杉植物（taxus）的皮，其含量仅为 0.010.05%。因过度的采伐，紫杉的来源日趋紧张， 已被国家列为保护植物。寻求紫杉醇或其替代品的新资源已成为迫切的任务。根据报道资料 蒙大拿州立大学植物病理学家 strobel 和化学家 stierle 等在 1993 年首次报道了从太平洋 红豆杉树上分离出来一种可产生紫杉醇的内生真菌，这种真菌被命名为安得列亚菌（taxomyces andreanae），其紫杉醇产量可达 2450ng/l1。这一发现具有重大的科学意义 和潜在的商业价值，为人们展示了一个可生产紫杉醇的新途径。笔者从中国红豆杉获得的77 株内生真菌中，通过对内生真菌的分离、筛选和发酵条件等方面的研究，对微生物发酵 法生产紫杉醇进行了探索，筛选到产紫杉醇的真菌，现报道如下：1.材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株来源：从采自四川省的中国红豆杉（taxus chinensis）中内分离得到的 77 株内生 真菌。1.1.2 培养基：真菌活化培养基：马铃薯培养基（pda 培养基）；发酵培养基：pda 液体培 养基1.1.3 对照品：紫杉醇（paclitaxel）中国药品生物制品检定所（批号：1534-200001）1.1.4 薄层色谱分析： 萃取液：乙酸乙酯；层析板：硅胶 g 板(薄层层析用硅胶 青岛海洋化工厂生产)展开剂：二氯甲烷:正己烷:甲醇:三乙胺（4.5:3.4:0.1:1.0）和三氯甲烷:乙腈:甲醇（9:1:05） 显色剂：5%香草醛浓硫酸溶液。1.1.5 hplc分析：日本岛津shimadzu高效液相色谱仪，lc-10a泵，spd-10a检测器，n2000 色谱工作站，diamonsil c18 柱（5 4.6255mm）。流动相：乙腈:水=1:1，流速：1ml/min， 检测波长：227nm。1.2 方法1.2.1 初筛方法将各菌株分别接种于 100ml p 瓶的 pdb 中摇床培养（28，120r/min，57d），随后 将培养液连同菌丝一起冰冻后再充分破碎，用萃取液等体积萃取两次后，将有机相于 45 条件下减压蒸发浓缩、蒸干，残渣用约 0.5ml 溶解后转入 ep 管中，4000r/min 离心，取上清 液，待用。初筛结果如图 1：图 1 部分菌株代谢液的紫杉醇类物质 tlc 检测结果6、14 为紫杉醇对照品，其他均为样品1.2.2 复筛方法将经 tlc 分析后有与紫杉醇对照品相同迁移率斑点的菌号扩大至 500ml pdb 培养液 中，以同样条件培养 57d，发酵物也经冰冻、破碎、萃取、减压蒸发、浓缩等过程，所得 产物称量计重后用于高效液相色谱（hplc）分析，以进行定性和定量分析。tlc 鉴定如图2，hplc 鉴定如图 3：图 2 复筛部分菌株的紫杉醇类物质 tlc 检测结果1.rs-1 2.rs-4 3.sph-4 4.sph-2 5.紫杉醇对 照品图 3 复筛部分菌株的紫杉醇类物质 hplc 检测结果2.菌种的鉴定2.1 鉴定培养基：查氏培养基, 查氏酵母膏琼脂，麦芽汁琼脂2。2.2 用插片法制片观察如下图 4。rs4(1)rs4(2)rs4(3)rs4(4)图 4 复筛部分菌株的紫杉醇类物质 tlc 检测结果经初步鉴定 rs-4 为木霉属真菌。木霉属(trichoderma pers),分生孢子梗无色，许多分枝， 不是轮枝状，小梗单生或成群；分生孢子（梗孢子）无色，单孢，卵圆形，着生成小的顶生 的簇，通常由于它生长迅速和分生孢子的绿斑或垫而易识别。sph-4（1）sph-4（2）经初步鉴定 sph-4 为曲霉属真菌米 曲霉原变种(aspergillus oryzae)，曲霉属 (aspergillus link),分生孢子梗直立，简单， 顶端球形或棍棒形膨大，顶部着生小梗或 自整个表面放射；分生孢子（梗孢子）单 孢，球形，成团时带有各种颜色，成干燥 向基的链。sph4（3）3.结论与讨论1994 年，邱德有等从云南红豆杉（t.yunnanensis）树皮中分离出了一种内生真菌yei， 但生物合成量低3；1996 年，strobel 等从西藏红豆杉（t.wallachiana）中分离到一株产生 紫杉醇的 内生真菌小孢拟盘多毛孢（pestalotiopsis microspora），这种真菌可以产生紫杉醇 的量为 50g/l4 ；此后，又分离到尼泊尔盘端角菌（seimatoantlerium nepalense）,其真菌产 紫杉醇的量为 6280ng/l5；2000 年，wang 等从南方红豆杉（t.mairei）中分离到一种可以 产生紫杉醇的内生真菌瘤座菌属（tubercularia sp.），其产量为 185.4g/l6。周东坡等人从 东 北 红豆杉 (taxus cuspidata) 中分离到 的 可产生 紫 杉醇的 内 生真菌 树 状多节孢 （nodulisporium sylviforme) 7，且是我国的新记录属，新纪录种8，培养产生的紫杉醇量为51.06125.7g/l7。后经几年来的菌种选育和发酵工艺条件研究，现紫杉醇产量达 448.52 g/l（摇瓶装量为 150ml/500ml）。树状多节孢hqd33（nodulisporium sylviforme) 内生真 菌融合子tpf-1 摇瓶发酵工艺条件的 条件下，2.8l和 10l罐发酵液中紫杉醇的含量达到406.95 和 395.12g/l（平均值）9。和组织培养、基因工程等相比较，真菌培养条件简单、 技术成熟，容易扩大化，一旦菌种的紫杉醇含量有所提高，就很快会成为一条切实可行的解 决紫杉醇药源危机的途径。本文所分得的菌株多集中于曲霉属，经过初步发酵后，经 tlc 初步鉴定，根据紫杉醇 对照品斑点颜色及 rf 位置确定再筛菌株，因野生菌株紫杉醇含量较低，很难看到有明显的 斑点。又因为初筛菌株较多，发酵量限制，做到不漏筛很困难。分得的三株菌中曲霉属的米曲霉原变种（aspergillus oryzae）产量约有 50g/l，距离工业化生产还有相当大的距离，但容易培养，相信经过育种和发酵条件的优化后，应该成为较有潜力的菌株。参考文献1 a.stierle, g.a strobel, d.sterile taxol and taxae productionbytaxomycesandreaaj anendophticfungus of pacific yew.science, 1993,260：214-2162 齐祖同主编中国真菌志(第五卷)曲霉属及其相关有性型m ，北京：科学出版社，1997，1773 邱德有，黄美娟，方晓华，等一种云南红豆杉内生菌的分离j真菌学报，1994，13(4)：314-316 4 strobel g a ,yang x s ,sears j,et,al taxol form pestalotiopsis microspora .an endophytic fungus of taxuuswallachianaj microbiology，1996，142：435-4405 bashyal b ,li j y ,strobel g a ,et alseimatoantlerium enpalense ，an endophytic taxol producing coelomycete form hima layan yew(taxus wallachiana) jmycotaxon ，1999，lxx：33-426 wang j w,li g l,lu h y,et altaxol from tubercularia sp.strain tf5.an endophytic funji of taxus maireijfems microbiology letters， 2000，193：249-2537 周东坡，平文祥，孙剑秋等紫杉醇产生菌分离的研究j微生物杂志， 2001，21(1)：18 8 周东坡，孙剑秋，于寒颖中国-新纪录属-多节孢属j菌物系统，2001， 20(2)：2779 刘晓兰，周东坡，孙剑秋，平文祥，等树状多节孢发酵生产紫杉醇工艺条件的初步研究j菌物系 统， 2002 ，21(2)：24preliminary screening of endophytic in taxus producingtaxelyan zhuyun，guo xiaoheng，luo jing，zeng qingqiuchengdu univercity of tcmchinese traditional medicine standerdization lab sichuanchengdu (610075)abstractobject to get fungil which pruduce taxel. methodsadopt the flat plate dilution separatedmethod ,after ferment,extraction was detected by tlc and hplc. resultfound 3 fungi which produce paclitaxel or its imitation. conclusion a totle of 77 endophytic fungi were isolated from stems and roots of taxus chinensis in dayi,sichuan province.paclitaxel or its imitation were found in its extracellular fluid idtificated by tl