茶黄素体内外抗氧化作用研究.pdf

1 1 孙世利，苗爱清，凌彩金，赵超艺，潘顺顺，庞 式 茶黄素体内外抗氧化作用研究 （广东省农业科学院茶叶研究所，广州 510640） 摘要：研究了红茶主要活性成分茶黄素的体外清除自由基能力和体内的抗氧化活性。结果表明，茶黄素表现出 了较好的体外清除自由基能力，而且对 DPPH、ABTS 和 OH 自由基的清除率呈剂量依赖性；小鼠饲喂不同剂量 茶黄素 30 天的试验结果表明，茶黄素能明显地提高小鼠肝脏中的 SOD、GSH-Px 活性，降低血清和肝脏中的 MDA含量。 关键词：茶学；红茶；茶黄素；自由基；抗氧化 In Vitro and in Vivo Antioxidant Properties of Theaflavins SUN Shili, MIAO Aiqing, LING Caijin, ZHAO Chaoyi, PAN Shunshun, PANG Shi (Tea Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China) Abstract: In the present study, in vitro radical scavenging abilities and in vivo antioxidant activities of the main active ingredients of black tea theaflavins were evaluated. Radical scavenging abilities evaluation of different concentration theaflavins included 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging ability, 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging ability, hydroxyl (OH) radical scavenging ability, and ferrous-ion chelating (FIC) ability. Theaflavins showed significant DPPH, ABTS and OH radical scavenging activity. Moreover, percent DPPH, ABTS and OH radical scavenging activities of theaflavins were dose-dependent. For antioxidant testing in vivo, the mice were fed with various doses of theaflavins everyday. The content of MDA, the activity of SOD and GSH-Px in mice serums and livers were measured after 30 days, which were compared with those of the control group. As results, theaflavins could obviously improve SOD and GSH-Px activities in liver, reduce MDA content in serum and liver. Keywords: tea science, black tea, theaflavins, free radical, antioxidant 茶叶是世界上消费量最大的无醇饮料之一，亚洲国家以绿茶消费为主，西方国家以红茶消费为主。 茶叶具有广泛的生理活性，大量的体内外研究都证明了茶叶多酚类具有抗氧化、抗癌、防辐射、治疗心 基金项目：广东省自然科学基金项目（9451064001003255）；广东农业科学院院长基金项目（201018） 作者简介：孙世利，男，博士，助理研究员，主要从事茶叶深加工与天然产物生物活性研究，中国茶叶学会，编号 A134400971M。Email： 2 血管疾病等多种功效1。绿茶中的主要活性物质是儿茶素类，而红茶中的主要活性物质是儿茶素类的衍生 物，茶黄素、茶红素等，其中研究较多的是茶黄素，茶黄素主要包括四个单体，其结构如图 1 所示TF1、 TF2A、TF2B和TF3。研究表明，茶叶发酵过程中并没有减弱红茶的抗氧化活性2。Leung等3研究报道， 红茶中的TF3 单体比绿茶EGCG单体的抗氧化活性强。本文以茶黄素复合物为实验材料，研究了其体外清 除自由基能力和小鼠体内抗氧化活性，以期丰富茶叶等天然产物的研究理论，为红茶天然产物的活性研 究及其药物或辅助药物的开发提供理论依据。 图 1 茶黄素四个主要单体结构图。 TF1=Theaflavin R1=R2=H; TF2A=Theaflavin-3-gallate R1=galloyl R2=H; TF2B=Theaflavin-3-gallate R1=H R2=galloyl; TF3=Theaflavin-3,3-digallate R1=R2 1 1 材料与方法材料与方法 =galloyl。 1.1 材料材料 茶黄素复合物(纯度50%)购自杭州英仕利生物科技有限公司；ABTS 和 DPPH 自由基标样购自美国 Sigma 公司；SOD、MDA、GSH-Px测定分析试剂盒购自南京建成生物研究所；其他试剂均为分析纯。 1.2 方法方法 1.2.1 茶黄素体外清除自由基能力茶黄素体外清除自由基能力 ABTS自由基清除能力测定参照Thana等4的方法。配制终浓度为 7 mmol/L ABTS和 2.45 mmol/L过硫 酸钾的混合液，室温避光条件下静置过夜(12 h)，制得ABTS自由基储存液，使用时用水稀释至 734 nm处 吸光度为 0.700.02 的应用液。将 100 L待测液加入 3 mL ABTS应用液，充分混合，室温下避光反应 6 min后测定其在 734 nm 处的测吸光度。计算公式：ABTS自由基清除率%=(Ablank-Asample)100/Ablank。 3 DPPH自由基清除能力测定参照Turkoglu等5的方法。配制 0.1 mmol/L浓度的DPPH的无水乙醇溶液， 将各样品配制成不同浓度的无水乙醇溶液，取DPPH溶液 1 mL，与 3 mL各样品的不同浓度的溶液混合， 充分混匀后，室温暗室放置 30 min，517 nm处测吸光值。以无水乙醇溶液代替各样品溶液作空白对照。 计算公式：DPPH自由基清除率%=(Ablank-Asample)100/Ablank 羟基自由基采用Fe 。 2+-H 2O2-酵母体系在化学发光仪(Lumat LB 9507, Germany)上进行化学发光测定。 用pH 5.6 的柠檬酸缓冲液配制 0.8 mmol/L FeSO4，5%的H2O2和 75 mg/mL的酵母溶液。在测定管中依次 加入 0.2 mL H2O2，0.2 mL酵母溶液，0.4 mL柠檬酸缓冲液配制的待测样品，最后加入 0.4 mL FeSO4，迅 速放入测定室，测定 2-30s的发光强度(CLI, 记数间隔时间为 3s)，空白以柠檬酸缓冲夜代替样品，每个处 理都重复 4 次。计算公式：OH自由基清除率%=(CLIblank-CLIsample)100/CLIblank 亚铁离子络合能力(FIC)测定参照Singh等 。 6的方法。分别配制 5 mmol/L菲洛嗪溶液和 2 mmol/L FeSO 4 溶液，分别稀释 20 倍，然后取 1 mL FeSO4溶液，加入 1 mL待测液，最后加入 1 mL稀释过的菲洛嗪溶 液，放置 10 min后，562 nm处测吸光度，以蒸馏水替代样品液作为空白。计算公式：亚铁离子络合 率%=(Ablank-Asample)100/Ablank 1.2.2 小鼠体内抗氧化作用小鼠体内抗氧化作用 。 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司的 40 只昆明小鼠(重量 1822 g)，随机分为 4 组，每组 10 只，给药组每天灌胃高(2.0 g/kgBW)、中(1.5 g/kgBW)、低剂量(0.5 g/kgBW)茶黄素，对照组以蒸馏水灌 胃，连续灌胃给药 30天后，首先用乙醚将其麻醉，然后摘眼球取血，每只老鼠平均取得 1.5 mL血，然后 4000 rpm/min 离心 5 min，取上清，得到小鼠血清。取血后的小鼠断颈处死后取肝脏放入 10 mL 离心管 中，同时加入 9 倍肝脏重量的冷生理盐水稀释，在组织匀浆仪上匀浆， 4000 rmp/min 离心 10 min，取上 清，得到 10%肝脏匀浆。最后采用试剂盒的方法检测血清和肝脏中 SOD 和 GSH-Px 的活性及 MDA 的含 量。 1.2.3 数据统计与分析数据统计与分析 数据分析采用 Origin7.5 软件。数值表示为平均值SD，用单因素方差分析检验，以 pTF-1EGCG，清除DPPH自由基能力的顺序为TF-3TF-2A/2BEGCGTF-1，而且茶黄 素在 3.2 mol/L浓度下清除自由基效果最显著。茶黄素除了作为预防性抗氧化剂清除自由基外，可作为链 阻断式抗氧化剂清除脂自由基。脂质在活性氧或辐射条件下产生自由基，引发脂质自由基链式反应。茶 黄素可与脂质链式氧化中间产物脂自由基或脂氧自由基反应，终止链反应而抑制脂质氧化。在鼠巨 6 噬细胞或人内表皮细胞中，TF-3 能减少细胞低密度脂蛋白(LDL)的氧化，抑制能力强弱依次为TF-3TF- 1EGCG EGCGA13 本研究中茶黄素表现出较好的清除 OH、ABTS 和 DPPH 自由基、络合亚铁离子能力，表明红茶具有 较强的抗氧化活性。但对于不同种类的自由基，茶黄素的清除能力有所不同，如本研究中随着茶黄素浓 度的增加，OH 自由基的清除率增加不如 ABTS 和 DPPH 自由基清除率增加的快。小鼠体内抗氧化作用研 究也证明了茶黄素在体内具有较高的抗氧化活性。另外，本研究中是采用茶黄素复合物为材料进行体内 外抗氧化效果初探，因此，今后有必要对红茶的有效成分单体进行更深入的研究，从单体的化学组成和 结构等方面对其抗氧化、防止癌症发生等活性进行研究，为红茶的保健作用研究和保健产品的研发提供 理论依据。 。 参考文献 1 孙世利，杨军国，张岚翠，等儿茶素与金属离子相互作用及其生物学意义J 细胞生物学杂志， 2007，29(2)： 225-228 2 Halder J, Bhaduri AN. 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