大豆糖蜜提取物中异黄酮和皂苷的分离和纯化.pdfVIP

- 1 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 大豆糖蜜提取物中异黄酮和皂苷的分离和 纯化 大豆糖蜜提取物中异黄酮和皂苷的分离和 纯化 张倩瑶，孔祥珍，华欲飞* 作者简介：张倩瑶，（1987-）女，硕士研究生，食品科学专业。 通信联系人： 华欲飞， (1962-)， 男， 博士生导师， 主要从事植物蛋白相关研究。 E-mail: （江南大学食品学院，江苏 无锡 214122） 5 摘要摘要：通过调节 pH 值，以及分步提取和添加壳聚糖，将大豆糖蜜提取物进行分离纯化。其 中调节 pH 值离心后白色沉淀加入 80%甲醇溶液两次提取，可将大豆异黄酮纯度从 15.50% 提高到 21.23%， 皂苷纯度从 32.81%提高到 57.23%。 上清液通过添加壳聚糖沉淀杂质可将异 黄酮纯度从 7.69%提高到 23.25%，皂苷的纯度从 12.56%提高到 29.63%。 关键词关键词：大豆异黄酮；大豆皂苷；壳聚糖；大豆糖蜜 10 中图分类号中图分类号：TS214.2 Isolation and Purification of the Isoflavones and Saponins from The Extracts of Soy Molasses ZHANG Qianyao, KONG Xiangzhen, HUA Yufei 15 (School of Food Scinence and Technology,Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122) Abstract: Using the pH adjustment method,as well as the fractional extraction and adding chitosan, soy molasses extracts were isolated and purified.After centrifugation of the white precipitate by adding 80% methanol extraction, twice the purity of soy isoflavones may be increased from 15.50% to 21.23% and the saponins purity from 32.81% to57.23%. Supernatant by adding 20 chitosan precipitate impurities isoflavones purity increased from 7.69% to 23.25% the saponins purity from 12.56% to 29.63%. Keywords: isoflavones; soybean saponin; chitosan; Soy molasses 0 引言引言 25 大豆糖蜜是以脱脂大豆粕为原料，醇法制备大豆浓缩蛋白生产过程中产生的一种副产 品，富含植物化学物质，应用价值极高。大豆中的主要植物化学成分为异黄酮、皂苷、BBI、 磷脂、无色花色素、植物甾醇、肌醇六磷酸、-3 脂肪酸及其他一些尚未确定的组分。 目前发现的大豆异黄酮共有 12 种，分为游离型苷元和结合型糖苷，共分为三个系列： 即大豆黄素系列，包括大豆黄甙、丙二酰基大豆黄甙、乙酰基大豆黄甙和大豆黄素；黄豆黄30 素系列，包括黄豆黄甙、丙二酰基黄豆黄甙、乙酰基黄豆黄甙和黄豆黄素；染料木素系列， 包括染料木甙、丙二酰基染料木甙、乙酰基染料木甙和染料木素。 大豆皂苷，属于三萜类齐墩果酸型皂苷，是三萜类同系物的羟基和糖分子(戊糖，己糖 或糖醛酸)环状半缩醛上的羟基失水缩合而成。它可以水解生成多种糖类和配糖体1。大豆 皂苷按现在的观点来看可以分为 A 组大豆皂苷，B 组大豆皂苷，E 组大豆皂苷和 DDMP 组35 大豆皂苷。 目前国内对从大豆糖蜜分离纯化异黄酮和皂苷的研究还不多， 国外对从大豆糖蜜中分离 纯化异黄酮和皂苷的报道主要来自于专利， 本文主要是以大豆糖蜜处理后沉淀为原料， 采用 丙酮和水作为提取溶剂，超声辅助提取，将提取物溶于水中，通过调节 pH，离心，上清添 加壳聚糖沉降杂质，沉淀用 80%甲醇分步提取，分离纯化异黄酮和皂苷。 40 - 2 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 1 材料和方法材料和方法 1.1 材料与方法材料与方法 大豆糖蜜由山东万德福实业集团有限公司提供，大豆异黄酮标准品（纯度 99.9%购于 sigma 公司） ， 壳聚糖 （(脱乙酞度 95%， 100kDa 购于青岛海维康生物制品有限公司)， Waters 600 高效液相色谱仪(美国 Waters 公司), 台式离心机 TPL-5（上海安亭科学仪器厂），旋转45 蒸发器 RE-52（上海亚荣生化仪器厂）。 1.2 分析方法分析方法 皂苷含量的测定：香草醛-高氯酸法2。 异黄酮总量测定：外标法，HPLC 法3，色谱柱，C18 柱(250 mm4.6 mm)；流动相， A 相： 三氟乙酸一乙腈溶液(三氟乙酸乙腈溶液体积分数为 0.5%)， B 相： 三氟乙酸水溶液 （三50 氟乙酸水溶液体积分数 0.05%）；检测器，紫外检测器；测定波长，254nm；色谱柱温度， 34；梯度洗脱；流速，1mL/min；进样量，20L。 脂类测定：氯仿甲醇法4。称取 100g 样品，以 1:10(V/V)的比例溶解于体积比为 2:1 的氯仿-甲醇溶液，提取 30min，抽滤，重复提取三次，滤液中加入 0.2 倍体积的 0.75%的 NaCl 溶液将氯仿相和甲醇相分开，其中氯仿相用 NaCl 溶液洗涤三次，以充分将非脂质成分55 洗涤出来，脂质成分主要集中于氯仿相中。氯仿相 50旋转蒸发除去氯仿，50真空干燥 4h，测定脂类质量。 1.3 异黄酮和皂苷的提取异黄酮和皂苷的提取 将大豆糖蜜 （粘稠液体状） 酸沉后得到糖蜜沉淀， 沉淀经冷冻干燥后成为大豆糖蜜干粉， 为实验原材料。 60 大豆糖蜜干粉经丙酮和水并超声辅助提取后得到提取液， 提取液经旋转蒸发除去丙酮和 水后，记为糖蜜提取物，将糖蜜提取物用氯仿甲醇法去除脂质，氯仿相旋干，真空干燥测定 脂类含量，甲醇相作为纯化异黄酮和皂苷原料。 1.4 pH 值对异黄酮和皂苷含量的影响值对异黄酮和皂苷含量的影响 甲醇相经旋转蒸发除去甲醇后，加水溶解，调节不同 pH 值，离心，分别测定上清液和65 沉淀质量，以及异黄酮和皂苷含量，比较不同 pH 值条件下离心异黄酮和皂苷纯度的变化。 将 pH 调节到 2.6，9000rpm离心 30min，分别测定上清液和沉淀质量，以及上清液和沉 淀中异黄酮和皂苷含量。 1.5 上清液中异黄酮和皂苷的纯化上清液中异黄酮和皂苷的纯化 配置壳聚糖溶液： 配 0.5%HCL 溶液 100mL， 40-50保温， 将 0.5g 壳聚糖缓慢加入 Hcl70 溶液中，并不断搅拌，直至完全溶解。 取上清液 100mL，调节 pH6.0，添加 7mL 壳聚糖溶液，有白色絮状沉淀析出，9000rpm, 离心 30min，分别测定上清液和沉淀质量，以及异黄酮和皂苷含量。 1.6 沉淀中异黄酮和皂苷的纯化沉淀中异黄酮和皂苷的纯化 沉淀中主要为一些酸性条件下溶解度较低物质， 取 10g 沉淀， 加入 100mL80%甲醇溶液，75 置于磁力搅拌器上搅拌 4h，充分提取。将甲醇液过滤，滤液测定质量，异黄酮和皂苷含量。 - 3 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 滤渣再加入 50mL80%甲醇相同步骤提取，过滤，测定质量，异黄酮和皂苷含量。 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 糖蜜提取物的成分分析糖蜜提取物的成分分析 取糖蜜酸沉冻干粉末 10g，用丙酮和水提取后，制备成糖蜜提取物，氯仿甲醇法测定脂80 类含量，甲醇相浓缩测定异黄酮和皂苷含量。 表 1 糖蜜沉淀提取物成分分析 Tab. 1 Composition analysis of extracts from the molasses precipitation 糖蜜沉淀提取物 异黄酮含量(除脂后） 皂苷含量(除脂后) 脂类含量 % 10.41 19.15 41.53 85 HPLC 梯度洗脱法测定异黄酮含量，大豆糖蜜提取物中异黄酮主要有四种，即黄豆苷、 染料木苷、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基染料木苷 (如图 1)。 图 1 糖蜜提取物中异黄酮 HPLC 图谱 90 Fig. 1 The HPLC chromatogram of isoflavones extracted from molasses 2.2 pH 值对异黄酮和皂苷的影响值对异黄酮和皂苷的影响 糖蜜提取物经脱脂处理后，取 10g 溶于 100mL 水中，分别调节到不同 pH 值，9000rpm 离心后取上清，测定上清中异黄酮和皂苷保留率。 95 异黄酮(皂苷)保留率%=上清中异黄酮(皂苷)总量*100%/甲醇相中异黄酮(皂苷)总量 异黄酮采用高效液相法测定，梯度洗脱，主要为四个峰，分别计算四种异黄酮保留率。 游离型异黄酮溶解性较差，基本不溶于水6。葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰 基葡萄糖苷型一般易溶于水。但染料木苷难溶于水。偏酸性条件下，糖苷形式异黄酮首先沉 淀出来，而不管是在偏酸性和偏中性条件下，丙二酰基形式异黄酮溶解度都较高，这可能是100 由于丙二酰基离子化所需 pH 值高，所以在偏酸性和偏中性条件下均可以离子化，所以溶解 度高，这与国外有关报道是相符的5。 - 4 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 上清中异黄酮保留率(%) 图 2 不同 pH 值上清液中异黄酮保留率 105 Fig. 2 Isoflavones retention rate of the supernatant of different pH 上清中异黄酮保留率(%) 图 3 不同 pH 值上清液中四种异黄酮保留率 Fig. 3 Four isoflavones retention rate of the supernatant of different pH 110 由图 2 和图 3 可以看出，在 pH2.6-4.0 时，异黄酮在上清液中的总保留率偏低，这主要 是由于糖蜜提取物种四种异黄酮含量都较高， 糖苷型和丙二酰基型含量相差不大， 在酸性条 件下，糖苷型异黄酮首先沉淀出来，而丙二酰基型异黄酮则大部分保留在上清液中，从而实 现了糖苷型(主要是染料木苷)和丙二酰基型异黄酮的初步分离。 115 由图 4 可以看出，在偏酸性条件下，皂苷的水溶性并不好，这主要是因为皂苷呈酸性， 分子量在 1000 左右，分子极性较大，在酸性水溶液中溶解度不高，故可以在酸性条件下沉 淀出来。而中性和偏碱性条件有利于皂苷的溶解。 - 5 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 上清中皂苷保留率(%) 120 图 4 不同 pH 值上清液中皂苷含量 Fig. 4 Saponins retention rate of the supernatant of different pH 综上， 在偏酸性条件下可以将大部分异黄酮和皂苷沉淀下来， 并且沉淀中异黄酮和皂苷 的纯度有较大提高。 125 将甲醇相旋转蒸发除去甲醇后，加水，调节 pH2.6，离心后上清和沉淀中异黄酮和皂苷 含量如表 2。 表 2 沉淀和上清中异黄酮和皂苷含量 Tab. 2 Isoflavones and saponins content of the precipitation and supernatant % 异黄酮含量 异黄酮纯度 皂苷含量 皂苷纯度 上清 31.05 7.69 38.12 12.56 沉淀 68.95 15.50 61.88 32.81 130 由表 2 可知，通过调节 pH 值后，有 68.95%的异黄酮和 61.88%的皂苷沉淀下来，并且 异黄酮的纯度由原样中的 10.41%提高到 15.50%，皂苷的纯度由原样中的 19.15%提高到了 32.81%。这样就实现了异黄酮和皂苷的初步纯化。 2.3 壳聚糖纯化上清液中异黄酮和皂苷壳聚糖纯化上清液中异黄酮和皂苷 上清液中异黄酮和皂苷纯度比原样有所降低， 杂质含量较高。 而壳聚糖是几丁质通过碱135 处理的聚电荷多糖， 能将溶液中具有负电荷的组分絮凝下来， 其中 pH 高与蛋白质等电点时， 蛋白质带负电荷，壳聚糖和蛋白质通过静电作用联接。同时在偏中性条件下，壳聚糖对于一 些酚酸类物质具有良好的吸附性7，这也有利于壳聚糖对上清液的杂质的沉淀。 表 3 壳聚糖澄清液中异黄酮和皂苷含量 140 Tab. 3 Isoflavones and saponins content of chitosan clarified solution % 异黄酮得率 异黄酮纯度 皂苷得率 皂苷纯度 壳聚糖澄清 89.00 23.25 69.42 29.63 由表 3 可知，壳聚糖良好的吸附性质，也能将部分异黄酮和皂苷絮凝下来，但由于壳聚 糖是大分子， 主要络合了一些溶液中带负电的大分子， 对异黄酮和皂苷的絮凝作用也只是由 于壳聚糖溶液的弱酸性，加入到上清液中降低了上清液的 pH 值，偏酸性条件本身引起了部145 分异黄酮和皂苷的沉降。异黄酮和皂苷的得率为 89.00%和 69.42%，纯度分别为 23.25%和 29.63%，纯化作用是比较显著的。 - 6 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 2.4 分步提取纯化沉淀中异黄酮分步提取纯化沉淀中异黄酮 经过调节 pH 值后，较大部分异黄酮和皂苷沉淀出来，沉淀中异黄酮和皂苷的纯度有较 大显著提高， 但要进一步提高异黄酮和皂苷的纯度， 并将染料木苷和其他形式异黄酮分离开150 来，需要进一步纯化。 沉淀用 80%两次提取，测定提取液中异黄酮和皂苷含量，如表 4。 异黄酮(皂苷)得率%=提取液中异黄酮含量*100%/沉淀中异黄酮(皂苷)总量 异黄酮(皂苷)纯度%=提取液中异黄酮含量*100%/提取液干重 155 表 4 沉淀分步提取液中异黄酮和皂苷 Tab. 4 Isoflavones and saponins content of step extraction liquid from precipitation % 异黄酮得率 异黄酮纯度 皂苷得率 皂苷纯度 第一次提取 38.57 18.01 21.78 21.53 第二次提取 61.43 21.23 78.22 57.23 分步提取后，第二次提取液中异黄酮和皂苷的得率分别达到了 61.43%和 78.22%，纯度 分别达到了 21.23%和 57.23%，纯度很高，可作为提取高纯度异黄酮和皂苷的原料。 160 分步提取后，四种异黄酮含量如表 5。 黄豆苷(染料木苷/丙二酰基大豆苷/丙二酰基染料木苷)得率%=提取液中黄豆苷(染料木 苷/丙二酰基大豆苷/丙二酰基染料木苷)量*100%/沉淀中黄豆苷(染料木苷/丙二酰基大豆苷/ 丙二酰基染料木苷)总量 黄豆苷(染料木苷/丙二酰基大豆苷/丙二酰基染料木苷)纯度%=提取液中黄豆苷(染料木165 苷/丙二酰基大豆苷/丙二酰基染料木苷)量*100%/提取液中异黄酮总量 表 5 沉淀分步提取液中四种异黄酮得率和纯度 Tab. 5 Four isoflavones yield and purity of step extracts from precipitation % 黄豆苷 染料木苷 丙二酰基大豆苷 丙二酰基染料木苷 第一次提取得率 56.40 14.78 71.71 58.42 第二次提取得率 第一次提取纯度 第二次提取纯度 43.60 25.81 11.97 85.22 19.23 66.51 28.29 10.18 2.41 41.58 44.78 19.12 170 由图 5 可知，第一次提取可将黄豆苷、丙二酰基大豆苷、丙二酰基染料木苷分离出来， 而第二次提取液中，主要为染料木苷，这使得经过沉淀，分步提取后，染料木苷进一步纯化 出来，与其他形式异黄酮分离开来，染料木苷占第一次提取异黄酮总量的 66.51% ，第二次 提取异黄酮总量的 19.23%，从而实现了染料木苷的进一步纯化。 3 结论结论 175 (1)糖蜜提取物经脱脂，调 pH 值，离心后，沉淀中异黄酮的纯度由原样中的 10.41%提 高到 15.50%， 皂苷的纯度由原样中的 19.15%提高到 32.81%。 得率分别为 68.95%和 61.88%。 并且实现了染料木苷和其他类型异黄酮初步分离。 (2)上清液通过添加壳聚糖后沉淀杂质，上清液中的异黄酮的纯度从 7.69%提高到 23.25 %，皂苷纯度由 12.56%提高到 29.63%。 180 (3)沉淀中异黄酮和皂苷再经过两步