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粮食与油脂16 2010 年第 12 期 05ls12-11 磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶研究 王建龙 1， 谢文磊1， 张军辉2， 杨 栋1， 张言献1 （1. 河南工业大学化学化工学院， 河南郑州 450001； 2. 中国检验认证集团河南有限公司， 河南郑州 450008） 摘 要： 以磁性壳聚糖微球为载体， 通过戊二醛交联进行脂肪酶固定化， 对影响脂肪酶固定化各种 因素进行考察， 确定最佳条件， 并比较游离酶与固定化酶 pH 和热稳定性。结果表明， 固定化适宜 条件为： 脂肪酶加入量 5.0 mg/100 mg载体、 温度 40、 时间 5 h、 pH 8.04、 戊二醛浓度 10%、 最高固 载率可达 90.56%， 酶活 4034 U/g载体； 与游离酶相比， 固定化酶 pH 和热稳定性都有较宽适用范围。 关键词： 磁性壳聚糖微球； 固定化酶； 脂肪酶 Study on immobilization of lipase with magnetic chitosan microspheres WANG Jan-long1， XIE Wen-lei1， ZHANG Jun-hui2， YANG Dong1， ZHANG Yan-xian1 （1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China； 2. China Certification & Inspection Group Henan Co.， Ltd.， Zhengzhou 450008， China） Abstract： Lipase （EC3.1.1.3） was immobilized on magnetic chitosan microspheres by using glutaraldehyde as coupling reagent. Different factors influencing the immobilization were investigated， and the optimum conditions were ascertained. Comparative studies of pH and thermal stability between free lipase and immobilized lipase were also conducted； The experimental results showed that the optimal conditions for preparation immobilized lipase were lipase 5.0mg/100mg carrier， immobilization time 5 h， temperature 40， pH=8.04， concentration of glutaraldehyde 10%. The maximum binding efficiency reached 90.08%， and the activity of immobilized lipase was 4034.74 U/g carrier. Therefore， the immobilized lipase holds excellent adaptability in a wider pH region and thermal stability comparable to free lipase. Key words： magnetic chitosan microspheres； immobilization； lipase 中图分类号： Q814.2 文献标识码： A 文章编号： 10089578 （2010） 12001604 收稿日期： 20101110 脂肪酶 （EC.3.1.1.3） 是一类特殊酰基水解酶， 能 在油水界面上催化酯水解、 酯合成、 酯交换、 高聚物 合成和立体异构拆分等有机合成反应 13；但游离 酶催化反应存在难以分离、 无法重复利用等缺点。固 定化脂肪酶， 不仅能保持酶催化高效和专一特点， 且 能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性； 同时， 易于 分离， 有利于酶多次重复使用及产品纯化 4 。 磁性物质作为一种绿色材料是近年研究较多材 料。纳米 Fe3O4由于粒径小、 比表面积大、 磁性强， 具 有表面效应、 磁效应等， 使其在颜料、 磁流体、 磁性微 球、 磁记录、 催化、 电子等领域得到广泛应用， 越来越 引起人们关注。谢文磊 56等研究磁性 Fe3O4 微球 固定化脂肪酶催化大豆油酯交换反应， 采用硅烷偶联 剂活化、 戊二醛交联和碳二亚胺活化两种方法制备磁 性固定化脂肪酶， 催化酯交换反应所得脂肪酸甲酯产 率都达 90% 以上。壳聚糖 （Chitosan） 是甲壳素脱乙 酰化产物， 是自然界存在唯一碱性氨基多糖， 一般可 由蟹、 虾壳中甲壳素经脱乙酰化反应制得。由于其成 本低、 资源丰富、 安全无毒， 具有独特分子结构和易于 化学修饰、 可生物降解、 生物可相容性和可再生性等 功能， 被广泛应用于水处理膜技术、 医药生物工程、 纺织等领域， 是很有前景生物高分子7。磁性壳聚 糖微球是一种新型功能高分子材料， 是指内部含有磁 性金属或金属氧化物 （铁、 钴、 镍及其氧化物）超细 粉末而具有磁响应性壳聚糖微球。由磁性壳聚糖及 其衍生物固定化脂肪酶具有酶活性高、 回收率高和 耐贮藏等特点。 1 主要材料与仪器 壳聚糖：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶 （2105U/g） ：北京凯泰新世纪生物技术有限公司； 50% 戊二醛： 天津市科密欧化学试剂有限公司。 水浴恒温振荡器：金山市华峰仪器有限公司； 722 可见分光光度计： 上海精密仪器有限公司； 组织 捣碎匀浆机： 江苏金坛医疗器械厂。 2 实验方法 2.1 磁体制备 56 称取FeCl3 6H2O 13.5 g 和 100 ml H2O 于三口烧 瓶中， 室温条件搅拌至溶解完全， 再加入 FeSO4 7H2O 粮食与油脂2010 年第 12 期 17 05ls12-11 8.3 g， 搅拌溶解后， 滴加浓氨水， 使反应液 pH 至 10； 常温搅拌反应 1 h 后， 升温至 80熟化 30 min， 水洗 至中性， 磁分离， 低温干燥。 2.2 磁性壳聚糖制备 89 将 1 g 壳聚糖完全溶解于 2% 50 ml 醋酸溶液中， 加入 5 g 磁体 Fe3O4、 50 ml 石蜡、 7 ml 石油醚、 7 ml Span80， 搅拌 10 min 后加入 1 ml 戊二醛， 常温反应 1 h， 然后再加入1 ml戊二醛， 升温至70反应2 h， 分 别用石油醚、 丙酮、 水洗涤， 磁分离， 干燥。 2.3 脂肪酶固定化 用 pH = 8.04 磷酸缓冲液配制一定浓度戊二醛溶 液20 ml， 加入2.5 g磁性壳聚糖， 常温搅拌40 min， 然 后水洗、 磁性分离除去上清液； 再加入一定浓度脂肪 酶溶液 （pH=8.04 磷酸缓冲液） ， 室温下搅拌 5 h； 缓冲 液洗涤， 分离产品， 低温干燥， 4下储存。 2.4 酶活测定 用橄榄油乳化法测定脂肪酶水解活性 10 。脂肪 酶活力以脂肪酶活力单位表示， 定义为 1 g 固体酶粉 （或 1ml 液体酶） ， 在一定温度和 pH 条件下， 1 min 水 解底物产生 1 mol 可滴定脂肪酸， 即为 1 个酶活力单 位， 以 u/g（u/mL） 表示。 2.5 蛋白负载量测定 酶蛋白含量测定采用 Brandford 法 11 。以牛血 清蛋白 （BSA）为基准物， 马斯亮蓝 G250 与蛋白质结 合后， 其最大吸收为 595 nm。在 595 nm 处， 一定蛋白 质浓度 （01， 000 g/mL）内， 蛋白质含量与光吸收 成正比， 由此求出蛋白质含量。 酶固载率可通过下式计算： 固载率 （%） =（总蛋白量上清液蛋白量） / 总 蛋白量100% 3 影响固定化脂肪酶因素 3.1 脂肪酶加入量 图 1 脂肪酶加入量对酶固定化影响 （反应条件：缓冲液pH为8.04，固载时间5h，温度40， 戊二醛浓度10%） 从图 1 可看出， 随加酶量增大， 固定化酶活性和 固载率呈先增大后下降趋势。 当加酶量达5.0 mg时， 固定化酶活性最高；此时固载率也相对较高；此后 若再增大加酶量， 固定化酶活性和固载率呈下降趋 势。一定量交联后载体， 其活性基团数量一定， 在其 结合位点达到饱和前， 随加酶量增加， 载体结合酶量 增大， 固定化酶活力也随之增大。 后呈下降趋势原因： 在加酶量为 5.0 mg 时， 载体表面酶负载量已达饱和， 难以继续与反应介质中酶分子反应；也可能是随载 体上交联脂肪酶分子增多， 酶分子间空间位阻增大， 酶与载体亲和力降低， 同时载体表面酶分子自身空间 构象可塑性减小， 使底物扩散相对困难， 从而不能充 分发挥其催化功能， 导致活力有下降趋势。因此， 选 择 5.0 mg 作为最宜加酶量。 3.2 pH 值 图 2 pH 对酶固定化影响 （反应条件：固载时间5 h，温度40，加酶量5 mg， 戊二醛浓度10%） 从图 2 可看出， 固定化酶固载率和活性随 pH 升 高呈先上升而后下降， 当 pH=7.73 时， 固定化酶固载 率最高； pH=8.04 时固定化酶活性最高， 因此选取 pH=8.04 为最适 pH。 3.3 反应时间 图 3 反应时间对酶固定化影响 （反应条件：缓冲液pH为8.04，加酶量5 mg，温度40， 戊二醛浓度10%） 从图 3 可看出， 随反应时间不断增加， 固载率和 酶活都不断增大， 随后两者增加都趋于平缓。原因是 反应 6 h 后， 载体负载脂肪酶量趋于饱和， 若反应时间 进一步延长， 被固载脂肪酶量不会再有明显增加， 因 而固定化酶固载率和酶活也基本不变。综合考虑， 适 宜固定化时间为 5 h。 粮食与油脂18 2010 年第 12 期 05ls12-11 3.4 反应温度 图 4 反应温度对酶固定化影响 （反应条件：缓冲液pH为8.04，固载时间5 h，加酶量5 mg， 戊二醛浓度10%） 从图 4 可看出， 随反应温度升高， 对固载率影响 较小， 当温度 40时， 酶活性最高； 但温度高于 40 时， 酶活性迅速下降。原因是脂肪酶活性部位因温度 升高而遭到破坏， 导致固定化酶失活， 活性下降。因 此， 选择 40为最宜固载温度。 3.5 戊二醛浓度 图 5 戊二醛浓度对酶固定化影响 （反应条件：缓冲液pH为8.04，固载时间5 h，加酶量5 mg， 温度40） 增加载体活性侧基空间悬臂长度， 有利于减少空 间阻碍、 提高载酶量和增加固定化酶活性。采用戊二 醛交联将载体表面活性基团 （氨基） 转化为醛基， 悬挂 在粒子表面的 CHO 可与脂肪酶分子上 NH2反应， 用于酶固定。 从图 5 可看出， 当戊二醛浓度低于 10% 时， 固载率 和固定化酶酶活回收率随戊二醛浓度增加而增大； 当戊 二醛浓度高于 10% 时， 固载率和固定化酶酶活回收率则 有所下降。因戊二醛浓度较低时， 载体表面活性基团较 少， 载体机械强度差， 酶在粒子表面易脱落。然而戊二 醛既是交联剂， 又是酶失活剂； 当戊二醛浓度过高时， 除 过量戊二醛自身发生羟醛缩合， 固化成不规则物附在产 物表面， 影响粒子表面结构， 使酶不易被固定外； 还可能 会对酶活性中心产生束缚， 造成酶活力下降。 4 固定化酶催化特性 4.1 最适 pH 分别定义固定化酶和游离酶最高比活为 100%。 结果如图 6 所示， 固定化酶和游离酶最适 pH 值均为 图 6 pH 值对游离酶和固定酶影响 8.04。当反应溶液 pH 值低于 8.04 时， 游离酶和固定 化酶活性均随 pH 值升高而升高；当反应溶液 pH 值 高于 8.04 时， 两种酶活性又随 pH 值升高而降低。在 其它 pH 条件下， 游离酶活性均低于固定化酶活， 酶固 定后， 其磁性载体上含有大量氨基， 使整个磁性微球 带正电荷， 导致酶分子构象及其活性部位微环境发生 某些改变， 从而使固定化酶作用 pH 范围变宽。 4.2 最佳温度 图 7 温度对游离酶和固定酶影响 如图 7 所示， 分别定义固定化酶和游离酶最高比 活为 100%。结果如图 7 所示， 固定化酶和游离酶最 适反应温度均为 40， 因脂肪酶活性部位会随温度 升高而遭破坏， 导致酶热失活， 固定化酶和游离酶在 30 45范围内都保持较高活力。酶和高分子载 体结合固定化后， 结构变得牢固， 即使受热， 酶蛋白肽 链也难以伸展， 酶蛋白高级结构得以维持， 固定化酶 热稳定性显著提高。 4.3 红外光谱图 固定化酶经过磷酸缓冲液梯洗处理后进行干燥 检测， 对比磁性粒子与固定化脂肪酶红外谱图 （图 8） 看出， Fe3O4纳米粒子在 3， 380 cm1和 1， 638 cm1附 近都有一个较强吸收峰， 出现这些峰原因可能是由于 羟基， 氨基伸缩振动和氨基剪切振动所引起。固定化 脂肪酶在588 cm1、 2， 956 cm1处出现FeO、 CH2特 征吸收峰， 在1， 659 cm1， 1， 540 cm1处出现微弱脂肪 酶特征峰。由此可证明， 少量脂肪酶已固载于磁性微 球表面。 粮食与油脂2010 年第 12 期 19 05ls12-11 图 8 红外谱图 （a）Fe3O4；（b）壳聚糖；（c）磁性壳聚糖； （d）游离脂肪酶；（e）固定化酶 5 结论 以自制磁性壳聚糖微球作为固定化酶载体， 通过 戊二醛交联进行脂肪酶固定化， 其固定化最佳条件： 酶 5 mg/100 mg载体、 时间 5 h、 温度 40、 pH=8.04、 戊 二醛浓度 10%， 最高固载率可达 93%， 酶活 4034.74 U/g载体。与游离酶相比， 固定化酶热稳定性、 pH 稳定 性都优于游离酶， 表明磁性壳聚糖微球是固定化脂肪 酶良好载体， 且分离、 回收较方便。 参考文献 1 周健， 倪婉星， 张晓鸣 . 非水相脂肪酶催化体系分子筛脱水机 制的研究 J. 食品与机械， 2005， 21 （2） ： 7779. 2 SirirungW， Aran H K， Uwe T， et al. lipasecatalyzed synthesis of structured triacylglycerides from 1， 3diacylglycerides J. JAOCS.， 2004， 81 （2） ： 151155. 3 Wongsakul S， Prasertsan P， Bornscheuer U T， et al. Synthesis of 2monoglycerides by alcoholysis of palm oil and tuna oil using immobilized lipases J. Eur. J. Lip id Sci. Technol.， 2003， 105： 6873. 4 杨本宏， 蔡敬民， 吴克， 等 . 海藻酸钠固定化根霉脂肪酶的制备 及其性质 J. 催化学报， 2005， 26 （11） ： 977981