管碟法测定抗生素效价详解.ppt

抗生素微生物测定法,一、概述,1.抗生素的概念及抗生素的生物检定 抗生素是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制其他病原微生物生长的一类天然有机化合物。 抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准。,2.抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。 效价（otency），指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。 单位（unit,u）单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。,（）重量单位 以抗生素的生物活性部分重量作单位 微克（）单位，毫克单位。 （）类似重量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的重量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克个单位。这是根据国际使用习惯而来的。 （）质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。青霉素0.6ug为1单位 （）特定单位 以特定的抗生素标准品的某一质量定为一单位。,管碟法 浊度法,抗生素微生物检定法,1、管碟法：是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含有一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出的透明抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌 圈的大小，计算出供试品 的效价。,2、浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。,管碟法测定抗生素效价 原理和方法,一、 原理 在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比，可以得出一条曲线。 抗生素浓度换算成对数，则抑菌圈直径与抗生素对数成直线关系,2.原理抑菌圈的形成,两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。,一、试验前准备,双碟的挑选,内径约90mm，硬质玻璃或塑料培养平皿，水平透明，无色斑气泡,物品的清洗、灭菌,培养皿、钢管、刻度吸管清洗后160干热灭菌2小时或121高压蒸汽灭菌30min，放置室温备用；陶瓷瓦盖要定期清洗干燥。,牛津杯的挑选,内径（6.00.1）mm，高（10.00.1）mm，外径（7.80.1）mm，重量差异不超过0.01g，光洁平坦,缓冲液的制备,磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠（Na2HPO4*12H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。 磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。,基本要点 ： 高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在1822mm； 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可较小； 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之比为4:1的比率。,仪器与用具 1 . 操作室 2. 双碟 3. 陶瓦盖 4. 钢管 5. 钢管放置器 6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶 10.毛细滴管或可调式移液器（11000l) 11.天平 12.抑菌圈(直径)测量仪。 13.超净工作台 用于菌种的接种或传代。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。,检定菌的来源：检定菌种由中监所所提供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌36个月（其他细菌每个月）用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要求进行。,冷冻菌种安瓶的接种。 用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁，稍干。 点燃酒精灯，将安瓿的封口，一端在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许在灼热处，使其骤冷而炸裂，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取少量灭菌水，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面，将营养琼脂斜面琼脂斜面于37恒温培养24小时。,管碟法的操作步骤,预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定,预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。,试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。,供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。,1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡；供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前12更换天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取，不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量不可少于20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸水。样品的称样量最好不少于50mg。,2. 稀释 稀释操作应遵照容量分析的操作规程。 从冰箱中取出的标准溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。举例：取浓溶液1000u/ml。第一步取5ml（1000U/ml）50ml容量瓶100U/ml；第二步取5ml（100u/ml）50ml容量瓶10U/ml（H）；取5ml（100U/ml）100ml容量瓶5U/ml（L）。 每次吸取溶液用刻度吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，以免因pH或浓度不同影响测定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。,3 双碟的制备 在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的污染，培养基应在水浴中或微波炉中融化，避免直火加热。 底层：用灭菌大口吸管（20ml）或其他灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放于3537培养箱中保温，使易于摊布菌层。 菌层:取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量按(2.2)法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm；用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水中(一般细菌4850，芽孢可至60)的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口10ml吸管或其他分装器，吸取菌层培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上并用陶瓦圆盖覆盖，放置20 30min，待凝固，备用。,4放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上，托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高度基本一致，钢管放妥后，双碟静置510 min,使钢管在琼脂内稍下稳定后，再开始加抗生素溶液。 5滴加抗生素溶液 每批供试品取610个双碟，滴加溶液可调式移液器，在滴加之前须用滴加液洗23次。滴加溶液的顺序:SHTHSLTL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。,二剂量法（2 2法）：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定；,双碟底层的制备： 每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固，待用。,菌层的制备： 菌层培养基：在培养基中添加一定量的菌悬液，振摇混匀。注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量。 每只双碟加入5ml菌层培养基。 注意制备菌层的速度和平整度。,待菌层凝固干燥15min左右，放置钢管，待钢管自然沉降15min后，按SHTHSLTL顺序滴加药液。,滴加抗生素溶液：,注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。每组双碟至少为8个，一般为10个。,在每个双碟的4个钢管中，对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。,按SHTHSLTL顺序，分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。,双碟的培养： 根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。,抑菌圈的测量： 将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑菌圈和双碟，是结果造成偏离。 抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。,结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。,记录与计算 1. 试验记录 应包括抗生素的品种、剂型、标示量、生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人，抑菌圈测量结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录。当用测量仪测量面积或直径时，应将电脑测试、计算、统计分析的打印纸贴附于记录中。 2. 计算注意事项：a、浓度比不等于1.000时，如标准品溶液（S）d的浓度为1005u/ml,而供试品溶液(T)的浓度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可将D值设为1.000，而估计效价设为101.01% b、所测定的实际效价应在D值与估计效价乘积的90%和110%范围内，超出就应重新估计效价。如估计效价为100%，D=1.000，而测得的效价为115%，按110%重估效价再进行试验。 C、原料及不合格供试品，进行平行试验，配置两份标准品和两份供试品，一份标准品与一份供试品为一组滴样,结果判断 1. 可靠性测验结果认为可靠，方可进行效价和可信限率计算。 2.可信限率 考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的可信限率不得超过5%。上述各项规定都能符合者，试验结果成立。 3. 实验计算 所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。 4. 效价测定 一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。,克服常见的一些影响因素,1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象,1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160干热灭菌2h后备用。,2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基 2.1 样品与标准品溶液的配制 标准品与样品从冰箱取后，使与室温平衡。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管23次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。,2.2 培养基与缓冲液的配制 配制培养基与缓冲液时要按照配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响。培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。,3. 加注培养基 3.1 加注底层培养基 无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注6065的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。,3.2 加注培养基菌层制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。,4. 放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。,5. 滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SHTHSLTL的顺序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻