课件：实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）,实验目的,1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法 3、学习蛋白质染色的方法,分离蛋白质的方法,分离方法,沉淀法,层析法,电学法,实验原理,电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。,以蛋白质为例：,H,OH,H,OH,pHpI pH=pI pHpI,影响电泳迁移率的因素： 1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象 常见的电泳有： 1、醋酸纤维膜电泳、 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 3、毛细管电泳,负极,正极, ,表面带负电荷,带正电荷的水层携带粒子向负极移动,如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。,电渗作用：,电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。, ,以纸电泳为例:,血清中几种主要蛋白组分：,缓冲液pH=8.6,pIpH,血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动,醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维薄膜作为支持介质 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm,染色剂,一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色,2019/8/5,11,可编辑,实验器材,1、电泳仪及电泳槽 2、醋酸纤维薄膜（28cm） 3、培养皿 4、点样器（盖玻片） 5、滤纸 6、玻璃板（可用大培养皿背面代替） 7、镊子 8、毛细管 9、刀片,实验试剂,1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06) 2、0.5%氨基黑10B染色液 3、漂洗液100ml 4、透明甲液和乙液各20ml 5、人血清（严格防止血清沾到皮肤上，尤其是带有伤口的皮肤）,实验操作,1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。,3.点样： 点样前，取一张干净的滤纸，在距一边1.5cm处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。 点样时，用毛细管吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹，使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）,点样区,6.5cm,1.5cm,4.电 泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度（8片薄膜则为4.8mA）。通电10-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（8片薄膜则为8mA），电泳时间50-80min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。,5.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时可置于摇床，染色液用后回收到原瓶。 6.漂洗： 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然晾干。 7.透明 将干燥的薄膜浸入透明甲液2min后转入乙液1min，取出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷风吹干燥，置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石蜡中浸润。,8.记录和分析实验结果 透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5，分别为1，2，及球蛋白，6为点样原点,注意事项,1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可