血凝仪检测原理及应用.ppt

1,凝血仪的检测原理 及应用,2,（一） 凝血常规（常规凝血功能筛选组合） 1. 凝血常规1（6项） PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚体、AT-Ⅲ 适合于干部病房、ICU病房、呼吸内科、消化内科、血液内科、产科、肿瘤科、心内科、肾内科和术后出血患者等，以及其它科室60岁以上高危人群。 2. 凝血常规2（4项） PT、APTT、TT、Fib-C 适合于一般手术患者。,3,（二） DIC筛选试验组合 PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚体、FDP、AT-Ⅲ （三）血友病组合 PT、APTT、TT、ⅧC、ⅨC、Ⅷ抑制物检查 （四） 凝血因子全套检查 PT、APTT、TT、Fib-C、ⅡC、ⅦC、ⅧC、ⅨC、ⅩC、ⅪC,4,（五）药物性出血的监测 1. 口服华法林治疗监测组合PT 2. 普通肝素治疗监测组合 TT、APTT、AT-Ⅲ 3. 溶栓药物治疗（SK、UK、t-PA）监测组合 PT、APTT、D-二聚体、TT、Fib-C、FDP,5,出血 血栓形成,,,,,,正常,止血血栓,6,三个阶段，两个途径 （内源性、外源性）,第一阶段凝血酶原激活物形成 第二阶段凝血酶形成 第三阶段纤维蛋白形成,7,凝子因子参与的凝血途径,内源性凝血途径Ⅷ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅻ 外源性凝血途径Ⅲ，Ⅶ 共同凝血途径Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ，ⅩⅢ,8,,,9,传统的凝血途径的修改,外源性的Ⅶ因子在组织因子的结合下既可激活Ⅹ因子，又可激活内源性的第Ⅸ因子，从而打破了内源与外源的界限。 Ⅻ因子缺乏时并不引起出血，这说明第Ⅺ因子并不一定只被Ⅻ因子激活，现已证明Ⅺ本身具有自身激活作用。 凝血酶（Ⅱ因子）也可激活Ⅺ因子，原来认为只有Ⅻ因子才能激活Ⅺ因子。 TF被激活并与Ⅶ因子结合后会被一种组织因子途径抑制物（TFPI）所抑制；后者已成为一种新型抗凝剂。,10,二、凝血检验标本收集和预处理,11,（一）标 本 采 集,1. 抽血注意事项 （1）抽血管首选优质塑料管； （2）定量抽血完毕，立即将标本轻柔颠倒混匀5次，避免剧烈摇动； （3）许多专家建议抽血的第一管血不用作血栓试验，尽量选第二管。,12,2. 抗凝剂问题 （1）世界卫生组织/美国临床和实验室标准协会（WHO/CLSI）都推荐使用0.109mol/L枸橼酸钠（3.2 Na3C6H5O7﹒2H2O）作为凝血检验的抗凝剂； （2）一般选用1份抗凝剂9份静脉血当Hct 25～55时； （3）若Hct ＜25或＞55时，抗凝剂的用量0.00185全血量[1- Hct] 100；,13,Hct异常时抗凝剂和抽血量,,,,,14,高Hct的影响,病例真性红细胞增多症患者，Hct 0.562 （1）19比例抗凝结果（错误） PT 19.2s，PT-INR 1.78，APTT 62.1s， Fib-C 1.67g/L，TT 22.9s，与临床不符。 （2） 0.2 0.00185（100-56.2） 计算后应抽血2.5ml，结果（正确）为 PT 13.9s，PT-INR 1.30，APTT36.2s， Fib-C 1.70g/L，TT 19.7s，与临床相符。,,15,（二） 离心问题 1. 血栓试验使用的血浆为PPP； 2. 一般要求2000～2500g/min（3000r/min ），离心时间为10min左右，转速N（转/分）与“g”的转换关系g11.1810-7半径（mm）N（转/分）； 3. 离心温度室温即可，但不可超过25℃，4℃离心条件应该提倡。,16,（三） 即时试验标本的要求 1. 标本尽可能在4小时内完成； 2. 筛查试验和一些因子测定时，应避免将标本长时间室温放置； 3. Ⅶ因子测定时，标本要避免冷藏。,17,（四）分离后血浆标本的处理,1. 建议将标本保存在-70℃以下条件，凝血因子至少可稳定6个月； 2. 短期保存可在-35℃条件，-20℃条件通常是不理想的； 3. 冷冻血浆解冻应放置37℃水浴条件，并轻轻摇动4～5分钟，分析前轻柔地颠倒混匀。室温放置自然解冻是不可取的，因室温放置会有冷沉淀形成，ⅧC和vWF会减少，并有纤维蛋白原析出。冷冻过的血浆不能再次冷冻。,18,XII,,XI,,IX,,VIII,外源凝血途径 检查 PT,内源凝血途径 检查 APTT,组织因子,VII,,X,Xa,,,,,II 凝血酶原,IIa（凝血酶）,,I FIB,,Ia 凝块,,V,,组织因子途径,TF,TFPI,,,,,,,共同途径途径 检查 TT,凝血途径示意图,19,三、凝血酶原时间测定（PT）,20,,,,,III,IV,PL,,,,,,III,,,X,II,,VII,,XIII,,,,,,,,,,,I,IX,VIII,VII,V,IV,III,II,,XI,,XII,,,,,,,,,,,in Blood血液中,in Plasma血浆中,PT Reagent,Fibrin,Extrinsic System 外在系统,,,Measure Clotting Time,without,,Tissue Factor,Blood Sampling,without,without,Trisodium Citrate,,,Normal Range 9-14 sec,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,37℃,,,X,V,I,XII,XIII,X,VII,IX,VIII,V,IV,II,III,I,,,,Phospholipid,XI,,XIII,（一）检 测 原 理,21,PT检测的原理,在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原与转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需的时间即为凝血酶原时间。CA1500仪器法判断终点采用光学法，即当纤维蛋白原转变为纤维蛋白时，经光照后产生的散射光发生变化，仪器判读终点。,22,（二）临 床 应 用,1. 延长 （1）见于先天性外源凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、 Ⅹ）缺乏症和低/无FIB血症，凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、 Ⅹ轻微减少，PT的延长幅度也不大，Ⅱ因子减少病人，其PT经常在正常范围； （2）口服抗凝药，如华法令等； （3）维生素K缺乏症； （4）DIC及原发性纤溶症； （5）肝脏疾病； （6）血中有抗凝物质（狼疮抗凝物、抗磷脂抗体、肝素、FDP以及抗Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、 Ⅹ 的抗体）。,23,2 .缩短 （1）血栓前状态和血栓性疾病； （2）见于先天性V因子增多； （3）长期口服避孕药； （4）使用重组的Ⅶ因子治疗时； （5）标本放置在2～8℃， Ⅶ因子冷激活发生，使PT缩短。 3.口服抗凝剂的检测 PT和PT-INR是监测口服抗凝剂的常用指标，中国人PT-INR在1.5-2.5用药较为安全和有效。,24,低ISI试剂的优势,ISI1.0试剂 ISI2.0试剂 MNPT 11 sec 11 sec PT 22 sec 15.6 sec PT-INR 22/11 2.0 15.6/11 2.0 当系统误差是 21/11 1.91 14.6/11 1.76 1秒时的INR 23/11 2.09 16.6/11 2.28 INR误差范围 1.91 2.09 1.76 2.28,1,2,1,1,2,2,25,MNPT的确定方法,标本多份混合血浆（20份以上） 年龄18-55岁 性别男、女（非妊娠、非经期）各半 药物的影响 激素、抗生素、口服避孕药、降压药、维生素 采血前的要求勿剧烈运动空腹或只服少量无脂类食物,26,四、 活化部分凝血活酶時間 （APTT）,27,28,APTT检测的原理,37℃条件下，以白陶土（激活剂）激活因子Ⅺ和Ⅻ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2的参与下，观察贫血小板血浆凝固所需的时间即为活化部分凝血活酶时间。CA1500仪器法判断重点采用光学法，即当纤维蛋白原转变为纤维蛋白时，经光照后产生的散射光发生变化，仪器判读终点。,29,临 床 应 用,1 .延长 （1）见于内源性凝血因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏， 如血友病A、血友病B及Ⅺ 因子缺乏症； （2）严重的凝血酶原、Ⅴ、Ⅹ和FIB缺乏，如肝脏疾病、阻塞性黄疸、新生儿出血症、肠道灭菌综合征、吸收不良综合征、口服抗凝剂、应用肝素及FIB缺乏血症； （3）纤溶活性增强，如继发性、原发性纤溶亢进及循环血液中有纤维蛋白（原）降解产物（FDP）； （4）血液中有抗凝物质，如抗因子Ⅷ或Ⅸ抗体，狼疮抗凝物质等。,30,2.缩短 （1）高凝状态，如DIC的高凝期、促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等； （2）血栓性疾病，如心肌梗死、不稳定性心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成妊以及高症、肾病综合征和严重的灼伤等。,31,3.肝素治疗的监测 （1）肝素用于预防血栓形成时，APTT为同时检测的正常对照值的1.5倍； （2）肝素用于治疗的安全有效范围是APTT为同时检测的正常对照值的1.5-2.5倍。,32,APTT测定常见的问题,1. 分析前因素 2. APTT试剂（激活剂）,33,五、凝血酶时间测定（TT）,34,35,36,临 床 应 用,1 延长 （1）见于FIB水平或功能减低，如低FIB血症或异常FIB血症； （2）应用肝素或肝素类物质存在（如SLE、肝病和肾病等）； （3）见于FDP增多。,37,2 缩短 见于高凝状态 3 作为溶栓药物，如链激酶（SK），尿激酶（UK）和组织性纤溶酶原激活剂（t-PA）等溶栓治疗的监测指标。 TT在正常对照值的1.52.5倍 ，治疗安全有效。,38,TT测定常见的问题,1.分析前因素 2.TT试剂 ①凝血酶试剂 来源于牛； ②对肝素和FDP高度敏感； ③TT试剂保存时间较短，不宜重复使用。,39,PT、APTT、TT 联合分析一,40,OAT,PT、APTT、TT 联合分析二,41,凝血因子FVIII或IX或XI或XII缺陷,,,PT、APTT、TT 联合分析三,,,42,纤溶过程（纤溶系统）,FIB （纤维蛋白原）,纤维蛋白 血栓）,,,FSPs 包括D-D,,FDPs,,,统称FDP,纤溶酶,,,纤溶酶原,,抗纤溶酶,,激活剂,抑制物,抑制物,,,FDPFibrinogen Degradation Products FSPFibrin Split Products,43,六、纤维蛋白原测定（Fib-C）,44,45,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,OD,OD1,OD2,OD3,250mg/dl,125mg/dl,62mg/dl,OD3,OD2,OD1,0,62,125,250,Mg/dl[FIB],时间,OD,FIB,FIB,FIB,,OD x [FIB],,检 测 原 理（PT演算法）,PT演算法的原理,PT测定完后纤蛋白原会转变成纤维蛋白，其形成的浊度与纤维蛋白质的含量成正比，因此不需要任何试剂，即可由产生的浊度直接推算出纤维蛋白原的含量。,46,检测原理（免疫学方法）,①利用抗FIB多克隆抗体与FIB特异性结合反应进行测定； ②方法有免疫浊度、单向免疫扩散和ELISA等。,47,临 床 应 用,1 增高 （1）动脉粥样硬化 （2）糖尿病 （3）急性传染病，急性感染 （4）结缔组织病 （5）急性肾炎和尿毒症 （6）妊娠晚期和妊高症 （7）放疗后，灼伤，休克，外科 大手术后，恶性肿瘤等,48,2 减少 （1）DIC、原发型纤溶、重症肝炎，肝硬化； （2）作为蛇毒治疗（抗栓酶、去纤酶）和溶栓治疗（UK、t-PA）的监测指标。FIB在1.2 ～1.5g/L ，治疗安全有效。,49,方法学问题,① Clauss法功能检测，操作简单，结果可靠，WHO推荐为Fib-C的参考方法（凝血酶为30～100U/ml，OVB的pH值应在7.35）； ② PT演算法更快速，简便，且重复性较好，当Fib在正常范围或轻度异常时，与Clauss法结果差异不大，但当Fib＞6.0g/L或Fib＜1.5g/L时， PT演算法结果不可信，一般高于Clauss法；,50,Clauss法与PT演算法比较,51,七、D-Dimer测定,52,Visible agglutination,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,D,E,,,D,E,no agglutination,D-Dimer,D,E fragments,,,D-Dimer乳胶凝集方法,53,D-Dimer临床应用,D-Dimer增高提示机体内存在血栓形成和继发性纤溶亢； D-Dimer在血栓形成（高凝状态）、肝脏疾病和恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和治疗检测等方面具有较好的应用效果； 由于D-Dimer具有高度的敏感性和良好的阴性预期，对于排除肺栓塞和静脉血栓有较大的价值； 手术后患者D-Dimer可显著增高，发生静脉血栓和肺栓塞的风险较大，检测D-Dimer的水平变化可预测患者的血栓风险。,54,FDP临床应用,1. 原发性纤溶亢进时，FDP含量可明显升高。 2. 高凝状态、弥散性血管内凝血、肝栓塞、器官移植的排异反应、妊娠高血压综合征、恶性肿瘤、心、肝、肾疾病及静脉血栓、溶栓治疗等所致的继发性纤溶亢进时，FDP含量升高。,55,临 床 指 标,①D-Dimer 是交联纤维蛋白的特异性降解产物，是血栓形成的特异性指标； ②D-Dimer 是继发性纤溶的特异性指标； ③纤维蛋白原和纤维蛋白的降解产物统称为 FDPs。,56,D-Dimer与FDP比较,①D-Dimer 增高，说明血栓（纤维蛋白）形成并被降解，可诊断 DIC ，筛查静脉血栓，是特异性指标； ②FDP 增高，说明纤维蛋白原，及（或）纤维蛋白被降解，是非特异性指标。,57,八、抗凝血酶-Ⅲ测定（AT- Ⅲ ）,58,,,抗 凝 机 制,59,检测原理-发色底物法,应用肝素使标本中抗凝血酶III转换成抑制剂，使凝血酶失活。残余凝血酶采用动力学方法测量405nm吸光度的变化，公式如下,,,病人标本中吸光度线性降低与抗凝血酶III出现呈线性关系。,60,临 床 应 用,ATⅢ是组成抗凝血的主要成分，是维持凝血平衡的重要物质。先天性或后天性ATⅢ缺乏可导致高凝血症，临床上表现为血栓形成。 1.遗传性AT缺乏常染色体显性遗传 2.获得性AT缺乏 ①AT合成降低主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期等，常与疾病严重度相关，可伴发血栓形成； ②AT丢失增加见于肾病综合症； ③AT消耗增加见于血栓前期和血栓性疾病，如心绞痛、心肌梗死、脑血管疾病、DIC、外科手术后、口服避孕药、深部静脉血栓形成、肺梗死、妊高症等。 3.AT水平增高血友病A、血友病B、口服抗凝药物以及使用黄体酮类药物时，AT增高,61,AT在肝素治疗中的应用,62,63,,,先天性凝血异常分析,64,,,,65,Thank You ,