环境化学物的特殊毒性及其评价-遗传毒性.ppt

第六章 环境污染物的特殊毒性及其评价,主讲教师：刘 薇 大连理工大学 环境学院,生态毒理学 (Ecotoxicology),一般毒性和特殊毒性,急性毒性 亚慢性毒性 慢性毒性 蓄积毒性 局部毒性,致突变作用 致癌作用 生殖和发育毒性,一般毒性,特殊毒性,安全性评价,3. 污染物致突变作用机理,4. 污染物致突变的不良后果,5. 污染物致突变作用的评价,2. 遗传损伤的类型,第一节 环境化学物的致突变性及其评价,小鼠骨髓细胞微核实验,环境毒理学 实验,1. 引言,突变(mutation)是一种遗传状态、可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。,突变,自发突变 诱发突变,1. 引言,1.1 环境致突变作用(environmental mutagenesis),化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变， 可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关,1. 引言,1. 引言,1.2 环境致突变作用研究简史,遗传毒理学(Genetic Toxicology),化学性和放射性因素的致突变作用和机理、对人类接触致突变物引起的健康效应和预防措施的科学。,研究内容,潜在的致突变作用 致突变作用机制 建立新的检测方法 评价致突变物对人类健康的威胁,1. 引言,1.3 环境致突变剂 (Environmental Mutagen）,-9-,2. 遗传损伤的类型,机制,以DNA为靶,不以DNA为靶,基因突变,染色体结构畸变,染色体数目畸变,细胞水平,分子水平,损伤牵涉范围,显微镜 可见度,基因突变,染色体突变,基因组突变,碱基置换,移码突变,大段损伤,染色体数目畸变,染色体结构畸变,DNA链中正常的碱基配对,A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 C:胞嘧啶 G:鸟嘌呤,A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 G:鸟嘌呤 C:胞嘧啶,2. 遗传损伤的类型,2.1 基因突变,基因突变(gene mutation)：基因中DNA序列的改变，又称为点突变。,2.1 基因突变,移码突变：从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变。,使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常导致致死性突变,大段损伤：DNA序列上有较长的一段序列的重排分布，也叫DNA重排。,2.1 基因突变,2.2 染色体突变,染色体突变(chromosomal mutation)：染色体结构的改变，又称为染色体畸变。,断裂剂(clastogen)：能引起染色体畸变的外源化学物。,染色单体型畸变,染色体型畸变,a染色单体断裂,b三辐射体,c.染色体断片,d. 双着丝点染色体 e. 环状染色体 f-g. 无着丝点断片,2.2 染色体突变,2.3 基因组突变,基因组突变(genomic mutation)：基因组中染色体数目的改变，又称为染色体数目畸变。,(1)大加合物 代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类 后 果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位DNA的半保留复制和转录。,2.化合物的致突变机理,2.1 DNA加合物和交联分子的形成,苯并(a)芘,芳香胺,黄曲霉毒素B,(2)小加合物 代表物：烷化剂、亚硝基化合物 后 果：对DNA的构象影响较小，易导致碱基错误配对。 DNA甲基化、乙基化,2.1 DNA加合物和交联分子的形成,(3)DNA-DNA交联：DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接. 代表物：如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气、各种铂的衍生物 后 果：DNA在复制中不能解链，螺旋局部形成，DNA复制和转录完全停止，细胞死亡,丝裂霉素C,碱基类似物：与天然碱基的结构非常相似的外源化合物 后 果：引发碱基替代突变,2.2 碱基类似物在DNA复制时的掺入, 亚硝基引起的氧化脱氨反应 NH2OH的致突变作用 作用机制复杂，不同PH、 NH2OH浓度，产物不同 烷化剂的致突变作用 硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯、MNNG,2.3 DNA分子上碱基的化学修饰,2.4 嵌合剂的致突变作用,原黄素,丫啶橙,代表物：丫啶橙、原黄素等丫啶类染料分子 方 式：以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间 后 果：移码突变,化合物的致突变机理,1.碱基损伤 致突变物改变或破坏碱基的正常结构。 (1)碱基错配 (2)平面大分子嵌入DNA链 (3)碱基类似物取代 (4)碱基化学结构改变或破坏 2.DNA链结构损伤 (1) 形成嘧啶二聚体 (2) 形成DNA加合物和DNA蛋白质交联物,3.影响细胞分裂过程,4.对修复酶的影响,激活原癌基因或灭活抑癌基因,化学、物理、生物因素,原癌基因点突变 原癌基因扩增 染色体易位与基因重排 原癌基因抑制解除 抑癌基因缺失,原癌基因 抑癌基因,癌基因,致突变因素,机体对突变的修复,遗传毒性的后果及其形成机制,致突变作用,体细胞突变,生殖细胞突变,良性 肿瘤,恶性 转化,细胞 衰老,分化的胚胎细胞受损,未分化的胚胎细胞,显性 致死,隐性 致死,存活 突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷(流产/死胎) 癌变,出生缺陷(功能或结构畸形),流产 死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,3.遗传毒性检测实验,2 染色体畸变试验 哺乳动物细胞染色体畸变试验 微核试验 显性致死试验 小鼠遗传易位试验,3 DNA损伤与重组试验 细菌DNA修复试验 程序外DNA合成试验 姊妹染色单体交换(SCE)试验 SOS显色试验(SOS chromotest),1 基因突变试验 原核细胞微生物试验 真核微生物试验 昆虫试验 哺乳动物体细胞体外试验 小鼠基因突变试验,3.1 原核细胞微生物试验(Ames试验),利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株，根据受试物是否诱发沙门氏菌突变型(his)回复为野生型(his)的形成菌落的能力，测定受试物。,Ames试验方法,顶层琼脂培养基 混匀,Ames试验标准菌株和敏感性,标准菌株 TA97 移码突变 TA98 移码突变 TA100 碱基置换突变 TA102 碱基置换突变、对醛类、过氧化物及DNA交链剂比较敏感,脂多糖突变(rfa) 增加细胞壁的通透性 uvrB缺失 DNA损伤后修复力降低 R因子 增高诱变率,哺乳动物细胞（正向）突变试验,细胞株： 小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y) 中国仓鼠肺细胞(V79) 中国仓鼠卵巢(CHO) 人成纤维细胞或淋巴细胞,哺乳动物细胞野生型,BrDU,死亡,3.2 哺乳动物体细胞致突变体外试验,3.3 染色体畸变试验,细胞受到诱变剂的作用后，染色体数目和较大范围的结构改变。在细胞分裂中期，利用光学显微镜下直接观察到这些变化。,体外实验 中国仓鼠卵巢细胞 中国仓鼠肺细胞 外周血淋巴细胞,体内实验 小鼠骨髓细胞染色体畸变试验 小鼠睾丸细胞,*,细胞分裂周期,原理,染色体畸变试验方法,急性试验 染毒一次 亚急性试验 连续染毒5天 慢性实验 连续染毒3个月,淋巴细胞 培养细胞,中期相细胞,受试物,培养基,染色体数目 结构,秋水仙素 阻止纺垂丝形成,处死前2-4h 腹腔注射,体外实验,染色体畸变,染色体结构异常 裂隙、断裂、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环等 数目异常 多倍体或非整倍体,3.4 微核试验,在致突变剂作用下，染色体损伤产生的无着丝点染色体断片和环，在细胞分列时不能定向移动进入细胞核，残留在细胞质中。微核的着色和细胞核相同，比正常细胞核小。 本试验可以检测受试物的染色体断裂作用和非整倍体诱变作用。,微核试验方法,外周血淋巴细胞微核试验 细胞培养微核试验 植物细胞 非哺乳类动物细胞,3.5 显性致死试验,雄鼠,连续染毒5天 从染毒第一天起经过一个精子发育周期 （大鼠60天，小鼠35天）,未交配过的雌鼠同笼5天,妊娠1214天 剖腹,检查活胎数、早死胎数、晚死胎数,3.6 姊妹染色单体交换试验（SCE),SCE是指一个同源染色体内，两个染色单体之间DNA复制产物发生互相交换，可能与染色体断裂和重接有关。 判断受试物是否具有DNA损伤作用。,SCE试验原理示意图,第一次 细胞分裂,BrDU,BrDU掺入到新合成的DNA链,第二次 细胞分裂,BrDU掺入到新合成的DNA链,SCE交换,BrDU,遗传毒理学试验可信性评价,实验方法 灵敏性(%) 特异性(%) 准确性() Ames试验 17/19 (89%) 3/10 (30%) 20/29 (69%) 骨髓细胞染色体畸 18/18 (100%) 2/10 (20%) 20/28 (71%) 变试验或微核试验 显性致死试验 18/18 (100%) 8/10 (80%) 26/28 (93%),遗传毒性检测实验组合原则,1.应包括每一类型的遗传终点。应能检出基因突变、染色体断裂、重组作用、非整倍体或多倍体改变。 Ames试验，微核试验，细菌DNA修复试验，SCE。 2.应包括进化程度不同的物种。 3.体内外实验配合。体外试验应有体外活化系统。 4.应包括生殖细胞和体细胞。,USEPA遗传毒性评价试验程序,特异座位试验 形态学改变 生物化学改变,体内骨髓细胞遗传学试验 染色体畸变试验 微核试验,Ames 试验,体外哺乳动物细胞基因