EB病毒检测技术进展及临床应用.ppt

EB病毒检测技术及临床应用,概述,Epstein-Barr病毒（EBV） 疱疹病毒科，亚科，嗜淋巴细胞病毒属， 1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。 EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。,概述,传播途径：EBV感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播； 人感染EBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%。 1-6岁儿童、14-20岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中国家EBV感染多发生在儿童早期。,病原学,疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒4型 球形双链DNA病毒，基因组平均大小约为172 kb,EBV致病机制,原发EBV感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染附近的B淋巴细胞，受到感染的B淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。 EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期 ，约50%的原发性感染均表现为IM。,EBV在人体B细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者将成为终身带毒者。 在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。,EBV致病机制,EBV常见相关疾病,传染性单核细胞增多症 （Infectious mononucleosis,IM) 慢性活动性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV） EB病毒相关性嗜血细胞综合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS) Burkitts淋巴瘤 何奇金淋巴瘤,EBV感染的抗原表达,EBV溶解性感染期，可表达： 早期抗原（EA）： EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； EA出现表明EBV活跃增殖，EA抗体出现在感染早期； 衣壳蛋白（VCA） 晚期表达的结构蛋白 VCA-IgM出现在急性感染早期，VCA-IgG出现在急性感染期并持续存在 膜抗原（MA）： 细胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原 抗MA-IgM可用于早期诊断,EBV潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及： 核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）： 为DNA结合蛋白，在感染的B细胞核内； EBNA-1与感染有关，EBNA-2与细胞转化和永生化有关； EBNA抗体出现在感染晚期。 潜伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）： 在感染B细胞表面，与细胞恶化有关， 未翻译的转录物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目标,EBV感染的抗原表达,原发性EBV感染过程中首先产生针对衣壳抗原（capsid antigen, VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（early antigen, EA）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（nuclear antigen, NA）抗体产生， 抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持续终身,EBV感染的血清学诊断,传统检测策略的问题,EBV感染的血清学诊断,抗VCA-IgM和IgG可以同时出现，通常IgG出现较IgM晚，但偶尔较IgM出现早12周，抗VCA-IgM几周后检测不到 抗EA-IgG在发病后3-4周后升高，34月后检测不到 抗EBNA-1-IgG在发病后34周被检测到，持续终身，部分慢性EBV感染者检测不到 抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG终生持续阳性,EBV常见相关疾病,传染性单核细胞增多症(IM) infectious mononucleosis,特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征 1889年被首次描述为“glandular fever” 1920年正式定义为IM 1932年发现嗜异性凝集实验 1968年实验室工作人员感染EBV，出现IM临床症状和嗜异性凝集抗体，明确EBV是IM的病原,IM临床表现,25-30%的青少年和30岁的成年人原发感染EBV后表现IM 儿童时期EBV感染多为亚临床型或不典型症状 临床症状：发热、淋巴结肿大、扁桃体炎（灰白色渗出）、咽炎、肝脾肿大、眼睑水肿和皮疹、上腭粘膜出血点 皮疹经常发生于使用氨苄西林、阿莫西林和一些内酰胺类抗生素1周后，发生率90% 并发症：粒细胞减少、血小板减少、脾破裂、扁桃体肥大致气道阻塞、暴发性肝炎、溶血性贫血、再生障碍性贫血、中枢神经系统疾病,慢性活动性EBV感染, CAEBV chronic active EBV infection,1975年Horwitz首次描述一些持续性IM患者血清存在高滴度的抗EBV-VCA和EA抗体 1982年Tobi进一步描述并证实该病 1984年被称为慢性单核细胞增多样综合征 1986年被定义为慢性症状性EBV感染 1991年被称为慢性活动性EBV感染,CAEBV,发生于儿童或年轻成年人 该病表现为慢性或反复的单核细胞增多样症：发热、肝脾肿大、持续性肝炎、广泛性淋巴结肿大 EBV感染的NK和T细胞克隆扩增在CAEBV具有重要意义 通常是一种肿瘤前状态或者与严重免疫缺陷有关，可进一步引起EBV相关的T/NK细胞增殖性疾病 预后差，病死率高,CAEBV的诊断标准,1）持续性或反复发作的IM样症状 2）异常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG 和/或受累组织包括外周血检测到EBV基因组 3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解释,Okana M, et al. Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection. America J Hematol.2005,80:64-69,Hydroavacciniforme 牛痘样水疱,hypersensitivity to mosquito bites,CAEBV的诊断标准(1),临床症状 持续性或反复发作的IM样症状 发热、淋巴结肿大、肝脾肿大 并发症： 血液系统（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板减少、贫血） 消化系统（肝功能衰竭、消化道溃疡） 中枢神经系统 间质性肺炎 心血管（冠状动脉瘤、心肌炎、心瓣膜病） 皮肤（蚊虫叮咬过敏、皮肤牛痘样水疱 ）,CAEBV的诊断标准(2),血清抗体滴度异常升高 抗VCA-IgG1:640和抗EA-IgG1:160 抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈阳性 受累组织和外周血检测到EBV-DNA、RNA、有关抗原和克隆 PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量102.5copies/g 原位杂交：检测出EBER-1阳性细胞 Southern杂交：受累组织或外周血中检测出EBV DNA 免疫荧光：检测到抗原（EBNA、LMP） 感染的B、T、NK细胞、单核/巨噬/组织细胞检测到EBNA、EBER、EBV-DNA,EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症 EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH,是一种与EBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病 EBV感染所致CD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征 临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DIC，骨髓和其他组织见嗜血细胞、LDH、铁蛋白、微球蛋白 EBV-HLH常见于儿童和青少年,抗EBV病毒药物,无环核苷拟似剂 acyclovir（阿昔洛韦），ED50 0.3 ganciclovir（更昔洛韦）， ED50 0.05 valaciclovir（缬昔洛韦 ） 无环核苷酸 cidofovir，adefovir 焦磷酸盐 拟似剂 foscarnet（磷甲酸钠） 作用机制 作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制,EBV感染的实验室诊断,外周血分类 淋巴细胞50% WBC 不典型淋巴细胞10% WBC（系激活的CD8+ CTL） 血清学检查 嗜异性凝集实验（heterophile test/spot test） VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG 病毒学标志 在PBMC、血清、全血或感染组织检测EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP,EBV感染疾病的血清学诊断,临床需要回答的问题,是否感染EBV? EBV感染的时相？ 是否EBV活动性感染？ 疾病是否与EBV感染相关？,EBV实验室检测方法,病毒培养 免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术） 血清学方法（ELISA法，化学发光法） 基因诊断技术,嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在EBV还未确定为IM的病因之前，1932年引入临床实践诊断IM。 当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在病程第12周出现，持续约6个月。 在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达80-90，约10的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。,EBV实验室检测方法,EBV感染的血清学诊断评价,嗜异性抗体（heterophile antibody，HA）凝集实验（“spot” test） 嗜异性抗体（IgM）在发病后7天内出现，2-5周达高峰，可以持续6-12个月，偶有12个月后以低水平存在 HA阳性提示原发急性感染，EBV再激活感染几乎阴性 阳性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5岁儿童50% 假阴性：发病第1周内假阴性率25%，10%成人始终阴性 假阳性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、HAV肝炎,缺点 需要硬件设备 成本昂贵,优点 敏感性高 特异性强 操作简便,化学发光技术,胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,简便，快捷，敏感度和特异度较差,EBERS原位杂交试验 EBV潜伏感染的细胞含有大量的EBERlEBER2（EBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBV潜伏感染的细胞含有大约106拷贝EBERS，被认为EBV潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERS是诊断肿瘤是否EBV相关的金标准,EBV实验室检测方法,EBV病毒核酸检测,实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法 鉴别EBV健康携带者的低水平复制与EBV相关疾病患者高水平活动性感染。,EBV载量检测有多种方法，Real-time PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的EBV疾病进行Real-time PCR检测时，需要的标本不同。,EBV病毒核酸检测,EBV相关性疾病的病毒DNA定量检测,血清游离的EBV-DNA提示原发感染或者再激活 健康携带者血清EBV-DNA通常检测不到,传单的EBV感染实验室诊断,血清学检测： 同时满足下列2条者可以诊断为EBV-IM: 1.下列临床症状中的3项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大； 2.原发性EBV感染的血清学证据，满足下列2条中任一项： （1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG阳性，且抗EBV-NA-IgG阴性 （2）抗EBV-CA-IgM阴性，但抗EBV-CA-IgG阳性，且为低亲和力抗体,传单的EBV感染实验室诊断,DNA检测？: IM患者外周血中EB病毒载体在2周内达到峰值，随后很快下降。 至病程14天，多数EBV-IM患者血清中已检测不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均检测不到病毒核酸。 IM患者不推荐进行EB病毒载量检测,慢性活动性EBV感染的实验室诊断,EBV抗体检测,慢性活动性EBV感染的实验室诊断,DNA检测 绝大多数CAEBV患者PBMC中EBV-DNA水平高于102.5拷贝/ug DNA 部分CAEBV患者血浆/血清中EBV-DNA阴性 CAEBV患者血浆/血清中EBV-DNA水平与病情严重程度和预后有关,EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症,EBV-HLH可以发生在原发性EBV感染时期，既往EBV感染再激活时期 EBV-HLH患者血清中EBV抗体反应呈多种反应类型， 单