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微生物检验项目性能验证,1,Com.30550：Instrument/Equipment Performance Verification The performance of all instruments and equipment is verified upon installation and after major maintenance or service to ensure that they run according to expectations.2015/07/28 仪器/设备性能验证 所有仪器和设备在安装后以及重要维护保养服务后应进行性能验证，以确保其可以按照预期运行。 NOTE：Performance verification is necessary after repairs or replacement of critical components of an instrument or item of equipment. 维修或更换仪器，或者更换仪器关键部件后必须进行性能验证,Why？,2,CNAS-CL042：5.5.1.2: 新的鉴定系统使用前，应查阅已发表的完整、科学的系统评估文献作为性能验证 的初级证据，再按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定 系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果的符合性进行 验证。 CNAS-CL042：5.3.1.5 如果设备故障影响了方法学性能，在设备修复、校准后，实验室可通过检测质控 菌株或已知结果的样品的方式进行性能验证。,why,3,CNAS-GL41：临床微生物检验程序验证指南， 在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。 2016/5/30,why,4,微生物检验程序包括：显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验，血清学检查，抗原检查等各项检验活动，,5,实验室应根据分析类型和用途进行验证程序的设计、验证结果的统计学分析、建立新检验程序的可接受性能标准。 验证结果应证明该检验程序可用于检测或准确分析待测物的特点，通常验证计划和可接受标准应在验证开始前确定。,CNAS-GL41:4.2,6,验证计划和可接受标 准应与该分析物相关的国家/行业标准/权威出版物等保持一致。 定义可接受标准的方法之一是根据医学和临床要求确定总允许误差，但通常应用于定量检测。定性检测的可接受标准可以用一致性（符合率）表达。,CNAS-GL41:4.2,7,检验程序验证所使用的标本应为合格的临床标本或从回顾性/前瞻性临床标本中分离的菌株。 标本的采集应符合国家、地区法规要求。 已通过一种或多种方式确定性能的标准菌株或质控品（如国家或地方临床检验中心使用过的质控菌株）也适用。,标本,CNAS-GL41:4.2,8,显微镜检查,CNAS-GL41:4.3,9,涂片制备 染色镜检 染色方法包括手工染片和自动化仪器染片 结果报告 应在检验项目开展前进行性能验证，并由有经验的实验人员操作 所有样品及容器应当作具有传染性的物质，应按照实验室生物安全要求进行操作。,显微镜检查,CNAS-GL41:4.3,10,包括能力验证/实验室间比对，实验室内人员比对, 实验室如果开展手工染片和自动化染片，应该对两种方法进行实验室内比对。,验证要求,CNAS-GL41:4.3,11,样品数量 1.每项检查至少5份样本 2.需覆盖全部样本类型 3.无菌样本类型应包含阳性和阴性结果 4.应优先选择使用已知结果的留样 样本，不可获取时采用模拟样本,比对方案,CNAS-GL41:4.3,12,按照临床标本常用检验方式处理，由工作人员进行操作 进行手工染片和自动化仪器染片时涂片需同时制备两份 进行实验室间比对和能力验证时，需由当日在岗人员进行涂片，染色，镜检，结果报告 进行实验室内人员比对时，由本岗位人员负责制片，染色，所有从事显微镜检查的人员 进行镜检，结果报告，由专人进行结果统计。,比对方案,CNAS-GL41:4.3,13,结果报告 根据实验室程序文件规定进行结果报告。抗酸染色按照要求进行分级报告。 可接受标准 每项检查结果符合率80%。,比对方案,CNAS-GL41:4.3,14,15,一般培养（非血液标本）,CNAS-GL41:4.4.2,16,一般培养包括各类标本的细菌、真菌、支原体的培养。 标本类型包括痰液、尿液、粪便、分泌物、组织等 细菌包括厌氧菌和分枝杆菌等 培养程序包括标本处理、接种、培养基选择、培养条件选择等,一般培养,CNAS-GL41:4.4.2,17,每项检查，每种样本至少1份标本 无论商品化培养基还是自配培养基，都需要在使用前对培养基性能进行验证，验证菌株可选择质控菌株或临床菌株。 标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株均可用做验证菌株，实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。,验证要求,CNAS-GL41:4.4.2,18,直接接种法 按照实验室细菌分离培养的SOP，将待测标本接种到相应的培养基上，观察菌落生长情况。 注意：在直接接种法验证不合格的情况下要采用标准化菌悬液进行验证。,验证方案,CNAS-GL41:4.4.2,19,标准化菌悬液法 1.菌悬液制备 1）直接菌落法：挑取培养18-24h的菌落，在生理盐水中制备成0.5Mcf的菌悬液 2）生长法：从培养24h的培养物中挑取3-5个菌落至无菌肉汤中，孵育数小时使其达到0.5Mcf,验证方案,CNAS-GL41:4.4.2,20,标准化菌悬液法 2.接种 1）验证非选择培养基 用无菌肉汤或生理盐水将配置好的菌悬液进行1:100稀释，每个平板接种10uL，均匀涂布接种。如生长过密则进行1:1000稀释 2）验证选择性培养基 用无菌肉汤或生理盐水将配置好的菌悬液进行1:10稀释，每个平板接种10uL，均匀涂布接种。如生长过密则进行1:100稀释 3）验证培养管 用10uL未经稀释的菌悬液进行接种。,验证方案,CNAS-GL41:4.4.2,21,在选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典 型，并且能够抑制特定微生物的生长，可判定性能符合要求，验证合格。 在非选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典 型，血培养基上的溶血类型符合，可判定非选择性培养基验证合格。,可接受标准,CNAS-GL41:4.4.2,22,血培养,CNAS-GL41:4.4.1,23,临床微生物室血培养系统验证的目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物，以及仪器是否能及时检测出血液中大部分的微生物。,CNAS-GL41:4.4.1,24,血培养性能验证常用留样验证和血培养系统平行比对两种方法。 本实验室采用的是留样验证的方法，操作过程参照XJ-SOP-006细菌室检验项目性能验证,CNAS-GL41:4.4.1,25,验证应覆盖临床常见微生物 需氧成人/儿童血培养瓶验证菌株应包括:需氧/兼性 厌氧革兰阳性菌、需氧/兼性厌氧革兰阴性菌、苛养菌（如：流感嗜血杆菌、肺炎链球 菌等）和真菌， 厌氧血培养瓶验证菌株应包括兼性厌氧革兰阳性菌、兼性厌氧革兰阴 性菌、专性厌氧菌， 其他特殊用途血培养瓶参照厂家要求选择合适类型菌株进行验 证。,验证要求,CNAS-GL41:4.4.1,26,每种类型至少株，总体不少于 15 株。应尽可能使用真实患者的临床分离菌株 （性能验证用临床留样菌株宜经质谱或 DNA 序列分析确认）。对于特殊、苛养菌可使 用标准菌株或质控菌株。 某些特殊菌株需要在培养瓶中加入无菌、未使用抗生素的厂 家推荐血液标本，如不加可能不生长，如流感嗜血杆菌。,验证要求,CNAS-GL41:4.4.1,27,模拟临床血流感染患者的细菌含量。 若苛养菌需添加适量的新鲜无菌血液（成人瓶 5-10ml，儿童瓶 1-3ml）后置于血培养系统上进行培养、检测。,验证方案,CNAS-GL41:4.4.1,28,挑取培养18-24h的新鲜培养物，在生理盐水中调整为0.5麦氏浊度的菌悬液，然后倍比稀释。如图所示,验证方案,0.5Mcf 108CFU/ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,106CFU/ml,104CFU/ml,102CFU/ml,0.5ml,#4 10CFU/ml,29,从#4号试管里取3ml菌悬液注入血培养瓶内，同时取1ml菌悬液在平板上进行涂布接种，确认接种数量。 将接种好的血培养瓶放入仪器进行监测， 待阳性报警后移种平板，涂片染色，确认是否为接种菌,验证方案,30,在厂家说明书规定时间内检测出所有菌株则该方法通过验证。 3 天时间应足以 检测出至少 95%的临床相关细菌，须具备苛养菌、真菌、厌氧菌等的检出能力。 若未能 检出应使用相同菌株进行重复试验来验证。若仍不能检测，实验室和/或制造商应在临 床使用该系统前采取纠正措施。,可接受标准,CNAS-GL41:4.4.1,31,如果血培养仪升级，原系统和新系统的差别不大，使用的培养瓶也没有改变，那么由供应商技术代表核查仪器性能即可，无需再次验证。功能核 查将对孵育系统和光学系统以及软件是否按照制造商规定运行进行评价。,可接受标准,CNAS-GL41:4.4.1,32,33,34,微生物鉴定试验,CNAS-GL41:4.5,35,按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株，试验应覆盖实验室使 用的全部卡片种类和/或方法。,验证要求,CNAS-GL41:4.5,36,菌株种类的选择： 首先参照厂商说明书，覆盖革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、 厌氧菌、念珠菌、隐球菌等。包括临床留样菌株和标准/质控菌株。每种类型应至少 1 株，总体不少于 20 株。 参照实验室SOP规定对验证菌株进行检测，一 般要求鉴定至种水平。对于特殊类型的微生物（如棒状杆菌、厌氧菌，芽孢杆菌），可将鉴定到属的水平作为可以接受的性能标准。,验证方案,CNAS-GL41:4.5,37,标准/质控菌株符合率应为 100%，临床菌株的符合率应在 90以上。,可接受标准,CNAS-GL41:4.5,38,本实验室采用了连续20天检测待测菌株的方法进行了鉴定仪的性能验证试验。 一共选取了26株细菌和真菌，参照标准操作规程XJ-SOP-503 VITEK2 Compact标准操作规程连续测试20天。 GP、GN：如果失控的生化鉴定项目3个，可认为性能好可接受；如果质控检测结果和目标反应结果出现误差大于3个，必须立即进行查误步骤，如误差无法解决，则联系生物梅里埃/委托代理的技术代表。,39,40,41,血清学检查,CNAS-GL41:4.5.2,42,血清学鉴定试验包括沙门菌/志贺菌/致病大肠杆菌/弧菌等的血清学分型。,CNAS-GL41:4.5.2,43,沙门菌至少包括伤寒沙门菌/甲型副伤寒沙门菌/乙型副伤寒沙门菌/丙型副伤寒 沙门菌；志贺菌包括福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌四种；致病大肠杆菌/弧菌等根据当地卫生行政管理和实验室情况进行选择。霍乱弧菌每年由杭州市疾控中心进行检测验证。 优先选择标准菌株和 质控菌株，也可使用实验室确认过的留样临床分离株,验证要求,CNAS-GL41:4.5.2,44,参照实验室相关SOP进行 XJ-SOP-409沙门菌属、志贺菌属检验 XJ-SOP-410O1群、O139群霍乱弧菌检验,验证方案,45,要求准确率 100%。,可接受标准,CNAS-GL41:4.5.2,46,抗菌药物敏感性试验,CNAS-GL41:4.7,47,抗菌药物敏感性试验（药敏试验）可分为纸片法和最低抑菌浓度法（MIC 法）。,CNAS-GL41:4.7,48,药敏试验方法的评估宜既保证药敏试验的准确性，也要确保耐药菌株的检出灵敏性。 药敏卡的选择应遵循生产厂家 说明书要求，不应超范围使用。 药敏试验性能验证可使用药敏质控菌株。,验证要求,CNAS-GL41:4.7,49,参考 CLSI 细菌、真菌相关药敏试验操作及判断标准，选择药敏质控标准菌株和药 物。 连续检测 2030 天，每一组药物/细菌的抑菌圈直径或最低抑菌浓度（MIC）超出 参考范围的频率应不超过（）1/20 或 3/30； 也可采用替代质控方案，即连续 5 天， 每天对每一组药物/细菌重复测定 3 次，每次单独制备接种物，15 个数据中超出参考范 围（抑菌圈直径或 MIC）的结果应不超过（）1 个，若失控结果为 2-3 个，则如前述， 再进行 5 天，每天 3 次重复试验，30 个数据失控结果应不超过（）3 个。,验证方案,CNAS-GL41:4.7,50,连续MIC法应计算基本符合率（EA，essential agreement）：用于连续MIC法，AST设备得到的MIC结果与参考方法确定的MIC结果（或已知确认结果）相差在正负一个倍比稀释度内的符合率。,性能指标,EA=,实验MIC在已知参考MIC的1个倍比稀释度内的试验数,测试总数,100%,51,分类符合率（CA，category agreement）：用于非连续MIC法和纸片法，验证的药敏试验方法与参考方法或已确认结果间S/I/R判断的一致性。,性能指标,CA=,药敏分类结果一致的试验数,测试的总数,100%,52,在新的药敏试验系统应用于临床前，须满足上述质控要求，通过后在日常检测中 转为室内控制要求。应对较大和重大偏差进行分析，以确定特定细菌结果是否受影响 并要求限制该细菌和特定抗菌药物在该设备的使用