课件：病毒遗传分析.ppt

第四章 病毒的遗传分析,学习要点: 1 噬菌体的突变型及基因重组的特点； 2 噬菌体的互补测验与顺反子测定； 3 用两点测交与三点测交测定噬菌体交换值; 4 噬菌体基因组结构特点； 5 噬菌体的线状染色体与环状连锁图。,Background,一、细菌和病毒在遗传研究中的优越性 繁殖世代所需时间短； 易于管理和进行化学分析； 遗传物质较简单，便于用作研究基因结构、功能及调控机制的材料。 便于研究基因的突变； 便于研究基因的作用； 可作为研究高等生物的简单模型；,二、细菌和病毒的拟有性过程,细菌和病毒均属于原核生物不存在严格意义上的有性过程。 细菌细胞内除了染色体外还有核外DNA物质结构(如噬菌体和质粒)，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体，类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。,第一节 噬菌体的繁殖和突变型,噬菌体的繁殖 （一）烈性噬菌体的感染周期 遗传学上应用最广泛的烈性噬菌体是大肠杆菌（ E.coli ）的T噬菌体。它们的结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状。T偶列和T奇列有些不同，以T 4的结构最为典型.,（二）温和性噬菌体的感染周期 温和性噬菌体具有溶原性（lisogeny）的生活周期。这类噬菌体侵入细菌以后，细菌细胞并不马上裂解。 温和性噬菌体有两种类型。 （1）以为代表 （2）P 1 噬菌体 裂解周期： 溶源性细菌自发或经诱发裂解细菌 释放 子噬菌体。,Structure of T4 bacteriophage,T4 噬菌体浸染时的尾壳收缩 Contraction of the tail sheath of T4 (when infection of host cell),第二节 T4噬菌体,头,尾钉 （刺突）,尾,尾丝,尾鞘,一、结构,T4病毒粒子含有线形双链DNA，基因组长度166kb(千碱基对)； 其基因组DNA含5-羟甲基胞嘧啶以代替胞嘧啶，而且羟甲基是葡糖化了的。 T4 DNA聚合酶是在生物中发现直接参与DNA复制的第一种酶。,二、遗传图谱,三、研究方法 1、噬菌斑 2.一步生长曲线试验 3. 单菌释放实验,噬菌体生长的测定一步生长曲线,一步生长曲线：定量描述一群菌体内毒性噬菌体生长规律的实验曲线。,感染后培养过程,被噬菌体侵染的 菌群培养过程,定时取培养液与敏 感菌混合平板培养,不同取样时间培养液与敏感菌混合平板培养产生的噬菌斑数量的动态,四、基本术语 1.涂布效率（e.o.p）=噬菌斑/感染噬菌体颗粒数 2.感染复数m=噬菌体颗粒数/细菌数量 3.裂解量每个被感染细菌释放新的噬菌体的平均数,一、 噬菌体的突变型,(一)快速溶菌突变型（r）: 噬菌斑大于野生性并且边缘更为清晰，突变率为10-410-3。 正常噬菌体，r+，产生的菌斑小而边缘模糊 突变噬菌体，r -，产生的菌斑大两倍而边缘清晰,第二节 突变的类型,Benzer所用 T4的 r II突变就是遗传学研究中所用的第一个条件致死突变型。 T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为 rl， r II，rIII等，它们位于 T4染色体 DNA的不同区段，这 3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别。 T4 r II突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为 r II突变型。,（二)宿主范围突变型（h）：突变率为10-6， 不同的菌株中突变性不一样。,正常噬菌体，h+，只能以大肠杆菌B株(Ttor)为宿主 突变噬菌体，h-，能以B株和B/4株(Ttos)为宿主,(三) 条件致死突变型 1 温度敏感突变型 2 抑制因子敏感突变（sus） 噬菌体 细菌 正常基因 sus+ su- 突变基因 sus su+,（1）抑制因子敏感突变的概念： 例如：噬菌体mRNA基因 细菌tRNA基因反密码子 正常 突变 突变 正常 基因：5TAC 35TAG 3 3ATC 53ATG 5 mRNA 5UAC 3 5UAG 3 3AUC 5 3AUG 5 表型：酪氨酸 终止 5UAG 3,酪氨酸,酪氨酸,3AUC 5 酪氨酸,表5-2携带不同专一性抑制基因宿主中sus突变噬菌体的表现,（2）噬菌体的抑制因子敏感突变型类型及表现 琥珀型（amber）UAG 赭石型（ocher）UAA 乳白型（opal） UGA,（四）无义突变与无义抑制突变,无义突变：指一个为氨基酸编码的密码变为终止密码的突变。 无义抑制突变：指能抑制无义突变表现的突变。,第三节 噬菌体突变的重组试验,一 T2突变型及特性 细 菌 B/2 快速溶菌突变型：r 大噬菌斑； 野生型：r+ 小噬菌斑； T2宿主范围野生型: h + - 半透明 T2宿主范围突变型: h- + + 透明,二 T2突变型的两点试验,(一) 噬菌体杂交 h-r+ X h+r- Ecoli B ,表现型 基因型 透明,小 h-r+ 亲组合 半透明,大 h+r- 亲组合 透明,大 h-r- 重组合 半透明,小 h+r+ 重组合,(二) 噬菌体重组值的计算 重组噬菌斑数 重组值 = 总噬菌斑数,Ecoli：B + B/2,100%,三 T4突变型的三点试验,69.6%,9.6% ,17.5% ,3.3% ,作图： m 12.9 r 20.8 tu,27.1,12.9,20.8,第四节 噬菌体突变型的互补试验,一X174条件致死突变型的互补测验 1 互补测验原理 在限制条件下，能长出噬菌斑： 说明：两个突变型能发生功能互补，是两个基因。 在限制条件下，不能长出噬菌斑： 说明：两个突变型不能发生功能互补，是同一基因。,2.1 互补测验原理和方法 基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系的两个基本方法。 重组测验以遗传图距确定突变的空间关系，而互补测验则是确定突变的功能关系。,如 rII区有 3 000多个突变型都有相同表型. 这些突变型对E.coli K()寄主细胞致死，但可在E.coli B菌株细胞中增殖。 既然它们有相同表型，是否它们都影响同一种遗传功能？rII中这3 000多个突变型是属于一个基因还是属于几个基因？为划分这种功能单位界线，要进行互补测验。,用不同rll突变型成对组合同时感染大肠杆菌K()菌株： 如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体，那么必然是两个突变型称彼此互补（complementation）。 如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。,该方法测定重组频率极敏感，重组检出率达1/106，理论上可测得0.002%的重组值，实际上所观察的最小重组频率为0.02%。根据二点杂交的结果，可作成连锁图 。,互补测验结果发现，rII突变型可分成 r IIA和 r IIB两个互补群。 凡属rIIA的突变之间不能互补；同理属于rllB的突变之间也不能互补，只有rIIA的突变和rllB的突变间可互补，双重感染E.coli K()菌株后可产生子代。 说明 r 11A和 r 11B是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但它们又是功能互补的，要在.coliK( )菌株中增殖，两种功能缺一不可。可见r II是由于这两种遗传功能丧失而成的。,2.2 顺反子 反式排列:如果分别位于两条染色体上，组合方式称反式排列， 顺式排列:如果两个突变同时位于一条染色体上，则称顺式排列。,Benzer用反式构型检验突变间的关系。在互补测验中两个隐性突变如表现出互补效应，则证明这两个突变型分属于不同基因；如不能互补，则证明这两个突变型在同一基因内。,反式构型,顺式排列作对照，在顺式排列中，不论是两个基因的突变，还是同一个基因内两个位点的突变，在互补测验中均表现互补效应。,顺式排列,说明基因是一个独立功能单位：在顺式排列里两个突变位点集中在一个功能单位时，另一等位基因的功能完全正常，所以表现互补；在反式排列中两个等位基因各有一位点发生突变，都丧失功能，所以不能互补。 Benzer将不同突变间没有互补的功能区称为顺反子（cistron）。一个顺反子就是一个功能水平上的基因，因此常用顺反子作为基因的同义词。,第五节 缺失作图 Benzer研究 r II突变型时发现一些突变由于核苷酸对发生改变，称点突变(point mutation)。而另一些突变由于缺失相邻的许多核苷酸对，称缺失突变(deletion mutation)。,尽管两种突变形成相同表型效应，但有区别： 点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变（multisitemutation）； 点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆； 点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突变间不能重组。,一、缺失突变的特点,二、缺失作图原理,凡是能完成野生型功能的（互补的、产生噬菌体的），突变一定不在缺失区内；反之，突变一定在缺失区内。 缺失作图的优点：简便、精确 缺失作图的条件：系列缺失突变体，限制条件,三、 缺失作图方法 0.5ml E.coli B菌株培养物加1滴缺失型噬菌体和1滴待测r II突变噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条上，铺在长有E.coliK(A)菌株平板上，经培养如在纸条覆盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间发生重组，产生野生型噬菌体。,第六节 -噬菌体,, 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 噬菌体基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp。,噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。用感染大肠杆菌的噬菌体改造成的载体应用最为广泛。,,噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。,,,在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5 末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端），称为 COS 位点；,,柯斯质粒 (cosmid ， COS) ，由质粒和 DNA 的 cos 序列组成。柯斯质粒比噬菌体 具有更大的克隆能力，在真核基因的克隆中起到巨大的作用。,它的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3。当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。,可选择进入裂解生长状态（lytic growth），大量复制并组装成子代 噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）； 或者进入溶源状态（lysogenic state），将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。,,噬菌体基因组的结构,由于噬菌体既可以进行裂解生长，又可以进入溶源化状态，因此噬菌体基因组的结构是与它的这些特性相适应的，其中一些基因决定裂解生长，另一些基因决定噬菌体的溶源化，甚至还有一些基因可对这两种状态的转变行使调解作用。,这是怎么发生的呢？,噬菌体基因结构,根据DNA的环状结构，可将66个可编码的基因分成3个功能区（function block）： 右边的功能区参与衣壳形成和DNA的复制，称为右操纵子区； 左边的功能区与裂解生长和溶源化功能有关，称为左操纵子区； 中央功能区是基因组调控操纵子区，也称为免疫操纵子区。(见下图),噬菌体基因组的结构,A至为构成衣壳蛋白的基因，其中S，基因与裂解作用有关。,右操纵子区,右操纵子,cI 为阻遏物基因，其基因产物是噬菌体基因组早期转录的阻遏物；cro为操纵基因OL和OR的抑制物基因，其蛋白产物通过OR可抑制左向cI基因的转录。cII基因产物能激活和int转录，与噬菌体进入或维持溶源化状态有关。,中央操纵子区,N是抗转录终止基因，N基因产物能拮抗早期转录终止子tR1，tR2和tL1，tL2，使PL和PR的转录作用各自越过终止子区而继续向左和向右进行延伸转录。,左操纵子区,左操纵子,int是整合酶基因， int 基因产物能识别宿主细胞染色体DNA和噬菌体基因组上相应的att位点，并能催化二者的断裂和再连接。 att位点称为附着位点，在宿主细胞DNA上称为attB，在噬菌体DNA上称为attP， attB和attP位点分别有一段由15bp组成的同源核苷酸序列，借助同源性重组作用可使噬菌体基因组插入到宿主的染色体DNA上。xis为切除酶基因。 int和xis基因产物共同作用，能使att位点发生重组，并将原噬菌体基因组DNA从宿主染色体中切割下来，使噬菌体进入裂解过程。在左区还有c 基因，它的基因产物可行使c的功能，即激活c和int的转录。,三.噬菌体溶源化状态的建立,PL 、 PR ：左右向转录的启动子 PRM : C蛋白基因维持启动子，受C浓度调控 C蛋白：是PL、PR的主要阻遏物，并可自主调控PRM cro蛋白： PL 、 PR的阻遏蛋白，并可抑制PRM，抑制c表达,噬菌体裂解生长与溶源化的建立取决于两种阻遏蛋白C和Cro的合成。当C蛋白的合成占优势时， PRM被激活，C蛋白继续起始合成，因而溶源化状态建立；相反Cro蛋白合成占优势，则PRM被抑制，没有C蛋白的合成，于是噬菌体在 Cro蛋白的控制下进入裂解生长。 C Cro 溶源； C Cro 溶菌,自课本P589,噬菌体进入细菌后成环状。由于DNA上无调节蛋白。寄主RNA 聚合酶分别结合于PL和PR。 PR转录Cro蛋白。PL转录翻译产生抗终止蛋白N。,在抗终止蛋白N的帮助下，转录翻译出C、C蛋白。,在C、C蛋白作用下，PRE（ PRE主管建立溶源，repressor for establishment of lysogeny，位于cro和c之间）的操纵子向左转录c基因，产生C蛋白。,C、C蛋白活化PRE,OR,PR,PRM,PRE,C+C,PL(N),PL+PR,五、裂解周期的建立 以及溶源态与裂解周期的平衡,Xis是由噬菌体基因编码的蛋白，只有在裂解途径被激活时才会合成。此蛋白存在时，噬菌体基因组将始终维持独立的环状结构，不会被整合进宿主基因组中去。,噬菌体基因组的割离与整合可以被视为可逆过程，但割离需要额外蛋白协助才能进行,Xis （for excision）,Xis蛋白的三维结构示意图 -,Xis蛋白结合到DNA上的特殊位点，引起DNA分子弯折（140），在attR形成一个包括Xis，int和IHF在内的、活化的DNA-蛋白复合体，该复合体与attL上的蛋白合作，使两个杂合att位点之间的重组反应迅速发生。可见，Xis的作用同IHF部分类似。 除此之外，Xis还有抑制整合的作用，具体机理是Xis造成了DNA分子的弯折，不能形成整合所需（即有效结合int和IHF）的结构。,决定噬菌体进入溶源周期还是进入裂解周期因素是CI和Cro 这两种调节蛋白对左右两个操纵基因OL和OR结合的竞争。 阻抑物决定溶源，而Cro蛋白决定裂解周期。,Cro蛋白的作用,维持回路阻止阻抑物的合成，也