课件：抗体工程制药.ppt

19.1 概述 19.2 鼠源单克隆抗体的制备 19.3 基因工程抗体,第十九章抗体药物制备工艺,19.1 概 述,19.1.1 抗体与抗原,抗体（antibody，Ab）： 指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,Ig,Ab,化学结构上的概念,生物学功能上的概念,抗体的发现,德国学者Behring和日本学者北里于1890年在Koch研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。 将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。 Behring于1891年应用来自动物的免疫血清成功地治疗了一个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病例。,诺贝尔奖得主：德国科学家贝林,德国的细菌学家埃米尔冯贝林(Emil von Behring 1854-1917) 。1901年因其研究抗毒素血清，尤其在运用血清治疗防治白喉和破伤风等病症方面的贡献被授予诺贝尔医学奖。,抗原決定基, 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基, 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体, 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸,19.1.2 抗体分子的结构与功能,免疫球蛋白的基本结构 重链（heavy chain，H） 由450550个氨基酸残基组成，分子量5075 kDa根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重链分别为：、,免疫球蛋白的基本结构 轻链（light chain，L） 由214个氨基酸残基构成，分子量约25 kDa 轻链有 链和 链两种，一个天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可存在分别带有 链和 链的抗体分子，其比例具有种属特异性,可变区（variable region，V区） 轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列变化较大的区域 重链和轻链的V区分别称为VH和VL 分别占重链和轻链的1/4和1/2 VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（CDR），共同组成Ig的抗原结合部位 在V区中CDR之外的区域氨基酸组成和序列相对不变，称为骨架区（FR）,恒定区（constant region，C区） 靠近C-端氨基酸序列相对稳定的区域 重链和轻链的C区分别称为CH和CL 分别占重链和轻链的3/4和1/2 不同型Ig的CL长度基本一致，但不同类Ig CH的长度不一,Ig的结构域 两条重链和轻链均可折叠成数个球形结构域，每个结构域约由110个氨基酸残基构成 二级结构由反向平行的两个-片层（-sheet）组成，两个-片中心的两个Cys由一个链内二硫键垂直连接，形成“-桶状（-barrel）”结构，这种折叠方式称为“免疫球蛋白折叠（immuno- globulin folding）”,铰链区（hinge region） 位于CH1与CH2之间 含有丰富的Pro 易伸展、弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位 易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段,19.1.3抗体制备发展历程,（1）多克隆抗体 1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素 1937年， Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白、丙种（ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 获取多抗的主要途径是动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群 优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制备容易 缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而限制了其应用,（2）单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。 1975年，Khler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和治疗。,木瓜蛋白酶水解片段 水解部位是Ig铰链区二硫键连接的两条重链在近N-端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab片段和一个Fc片段 Fab片段即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成，为单价抗体片段，可与抗体结合，但不凝集 Fc片段即可结晶片段（fragment cry-stallizable），相当于IgG的CH2和CH3结构域，无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位,胃蛋白酶水解片段 作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C-端，水解后可获得一个F(ab)2片段和一些小片段pFc F(ab)2片段由两个Fab及铰链区组成，是双价抗体片段，可同时结合两个抗原表位，可发生凝集反应和沉淀反应 F(ab)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc片段免疫原性可能引起的副作用，广泛用作生物制品,（3）基因工程抗体 利用基因工程方法对鼠源全抗体的基因进行重组缺失修饰改型等，在原核微生物昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达，获得抗体。 包括鼠源抗体的人源化，人鼠嵌合抗体，改型抗体，小分子抗体和完全人源抗体。,19.2 单克隆抗体制备过程,杂交瘤细胞的制备 骨髓瘤细胞的选择 在杂交瘤细胞技术中，主要使用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是由抗体合成细胞克隆衰变而成的肿瘤细胞 尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞 细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好 融合时，活细胞数应至少大于90%,常用骨髓瘤细胞系,8-Ag：8-氮杂鸟嘌呤； 6-TG：6-巯基嘌呤,杂交瘤细胞的制备 免疫脾细胞悬液的制备 取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，用NH4Cl破碎红细胞，洗涤，调整细胞至所需浓度，备用 杂交瘤细胞的制备 骨髓瘤细胞悬液制备 收集经传代生长24 h的骨髓瘤细胞，洗涤后，计数，备用,杂交瘤细胞的制备 细胞融合 脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（23107）混合 加入PEG诱导融合，时间控制在2 min以内 用培养液将PEG融合液缓慢稀释 细胞融合的注意点 脾B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比例一般为(510)：1 PEG的分子量：一般选择40006000，浓度4050% 在PEG溶液中加入DMSO，可以提高细胞接触的紧密性，提高融合率 应严格限制PEG、DMSO和细胞接触的时间,杂交瘤细胞的筛选 筛选之前的细胞混合液中含有多种细胞 未融合的细胞：脾细胞、瘤细胞 融合的细胞：脾脾、瘤瘤、脾瘤 筛选：HAT选择性培养基 含次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T） 氨基喋呤阻断DNA合成途径，瘤瘤细胞不能合成DNA而死亡 脾细胞在一般条件下不能连续培养，亦很快死亡 骨髓瘤细胞是HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏细胞株，而脾细胞内含有HGPRT，因此杂交瘤细胞可利用H、A和T合成DNA而得以生长,用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。 PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在4006000，浓度在10%60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。,杂交瘤细胞的筛选 选择性培养方法 将融合细胞悬浮于HAT 培养液中，加入到含有饲养细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板内，每23天换液一次 换液时取出1/22/3培养液，加入等量的新鲜培养液 细胞融合后一周内用HAT 培养液，杀死杂细胞后，第二周改用HT 培养液（不含A） 从第三周起改用普通的RPMI1640完全培养液 从细胞融合后89天起可对上清进行抗体检测，筛选阳性克隆,杂交瘤细胞的筛选 筛选阳性克隆 筛选要求：微量、快速、特异、敏感、简便，可一次性检测大批标本 常用方法：免疫分析法，如ELISA,将抗原固定在微孔板上，细胞培养上清培育一定时间后，用酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应底物颜色变化，了解是否含有针对该抗原的抗体存在。,杂交瘤细胞的克隆化 克隆化：使单个细胞通过无性繁殖而获得该细胞群体的整个培养过程，这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同 原因：筛选出的阳性克隆中，大多数情况下产生抗体的杂交瘤集落不是来自单个细胞，其中可能混有不分泌抗体的细胞，这种细胞比分泌抗体的细胞生长快，容易占据优势；此外，刚融合的杂交瘤细胞不稳定，染色体易丢失 一般融合后的杂交瘤细胞要经过三次左右的的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆,克隆化方法 有限稀释法 将杂交瘤细胞悬液稀释至一定浓度，加入到96孔培养板中，使每个孔中的细胞尽可能为单细胞，经过一段时间培养最终形成细胞克隆 可在光学显微镜下观察到细胞分裂，直至细胞集落形成 克隆化方法 软琼脂培养法 将一定浓度的待克隆细胞与2%琼脂糖培养液混合，铺于底部含有1%琼脂糖培养液平皿的上部，待单细胞集落生长至12 mm时，用毛细管吸取单集落，转移到细胞培养板中培养 工作效率高，一次克隆化即可获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，但对操作熟练程度要求高,杂交瘤细胞库的建立 第一次融合的细胞在每次克隆过程中，均应对检测阳性的细胞扩大培养，冻存一定量的细胞 经34次克隆，100%杂交瘤细胞孔为分泌抗体阳性细胞时，扩大培养，冻存较大量的细胞，建立较完整的原始细胞库 原始细胞库中的细胞应包括原始融合细胞、每次克隆的细胞及建株的细胞，且建株细胞的溯源应明确 原始细胞库中的建株细胞经扩大培养，再建立一个工作细胞库，用于日常研究和生产,可获得10g/ml的抗体。多采用RPMI 1640培养液，添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。 改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。 无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。 悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml, 收集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108。,19.2.2杂交瘤细胞的培养工艺 （1）体外培养法：,基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。 优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。 缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。,（2）动物体内诱生法,可获得10m/ml的抗体。常用方法。,腹腔注射法,19.2.3 单克隆抗体的纯化工艺 凝胶过滤 用于IgG和IgM类McAb的分离纯化，常用Sephadex G 200为分离介质 抗体回收率5080%，纯度可达95%以上，能去除微量杂蛋白 阴离子交换层析 用于IgG类McAb的纯化，常用DEAE型弱阴离子交换剂 pH=5.5时上柱，抗体与介质结合，除去较多杂蛋白 pH=7.4时IgG1和IgG2能结合在DEAE基团上 IgG2a可在低离子强度下洗脱，纯度较高 IgG2b和IgG3在提高离子强度时洗脱,亲和层析 Protein A层析法为最常用，特别适用于IgG类单抗的纯化 pH值决定IgG与Protein A的结合程度，采用不同pH值的缓冲液可以选择性洗脱不同亚类的IgG 收获抗体的纯度很高 Protein A亲和介质价格较昂贵,疏水性电荷诱导层析（HCIC） HCIC介质配基中的硫原子对Trp和Phe等氨基酸有特殊的亲和力，因此HCIC配基能与抗体的Fc片段特异性结合 吡啶和咪唑等杂环在pH 410范围内不带电荷，减少了静电对杂质的吸附；当pH值降到小于配基的pKa时，杂环质子化，此时抗体也带有正电荷，产生静电排斥,A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作用靶组织时间； B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。,McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：,A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相对分子质量,需要解决的问题：,解决问题的方法或途径基因工程技术,1984年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。,19.3 基因工程抗体,基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,19.3.1人源化抗体,鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理,目的：一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量，增加组织通透性,原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（C）。在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体.,人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 方法： 将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,（1）嵌合抗体,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。,（2）改型抗体,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变,结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）,人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。,定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。 研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。,Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 单域抗体 最小识别单位,19.3.2小分子抗体,分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/80-1/3。,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,ScFv,连接肽,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。 单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法 单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3)单域抗体,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,(4)最小识别单位,CDR,可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,小分子抗体的优点及应用,应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗,优点：,19.3.3、双特异性抗体和多价抗体,双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双特异性抗体(bispecific