课件：临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班.ppt

基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用,刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所,中心法则,复 转录 翻译 DNA RNA 蛋白质 蛋白 制 反转录 糖蛋白 脂蛋白 酶类 激素 细胞因子,基因重组技术 基因探针技术,基因重组药物 基因诊断 基因治疗 PKU 尿毒症（口服artificial cells),基因诊断,运用基因探针， PCR技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。 基因型 表 型 基 临 血 生 细 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 诊 学 学 学 学 学 断 诊 诊 诊 诊 诊 诊 断 断 断 断 断 断,基因诊断的特点,灵敏度高（早期） 特异性强 操作简便 取材大多不受组织器官限制 可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断 检测细菌内病毒等微生物时不需培养,聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction（PCR）,Kary B. Mullis 1984 年问世, 成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑 1993 荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想 专利官司之战: DuPont 与Cetus对薄公堂,PCR 原理示意图,PCR技术的应用,一、在分子生物学研究中的应用 二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 血友病、 地中海贫血、DMD、PKU等等 三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等 四、病毒 五、白血病、肿瘤 六、骨髓移植、器官移植供体配型选择 七、法医学 八、动植物学 九、古人类学、古生物学,PCR原理示意图,热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性4分钟，使之解为单链。,退火：然后置反应混合物于55，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的Taq DNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。,引物延伸：置上述反应混合物于70水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始, 沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。,接着，将上述热变性退火引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍（2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。,如果引物5端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。,影响PCR效果的重要因素及注意事项：,PCR技术的原理似乎非常简单明了，PCR反应的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素,引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。 长度一般在18-25个碱基，Tm值可按公式（G+C总数x4）+（A+T总数x2）（）估算。 尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。 尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（Dimer）的可能性。 G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。 同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有引物）Tm值设计的相同。,引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PCR及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。 基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。 各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。 dNTP浓度要优化。,退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败，非特异产物的出现与否关系最大。 Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。 对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当增加。 操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。,荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较,HLA分型技术,HLA（人类白细胞抗原） MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区） 高度多态性的基因区,HLA分型技术,一、淋巴细胞微量细胞毒试验 1964年，Paul Terasaki, LA, USA 二、DNA分型法 优点： 1. 血样不要求新鲜; 2. 白血病患者WBC表面抗原被破坏, 只 能用DNA分型法; 3. 结果更准确可靠,HLA分型技术,DNA-RPLP, 1982 PCR/SSO PCR/反向斑点杂交 PCR/SSCP PCR/SSP PCR/SBT R-Q-PCR/SSP PCR/dHPLC等,在序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术基础上，将荧光定量PCR（FQ-PCR）技术与SSP结合起来，建立了自动化程度更高的荧光定量PCR- HLA分型技术，完成了46例尸肾供受者的HLA-DBR1分型。 FQ-PCR不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化程度。同时又开展了以DNA测序为基础的HLA分型（SBT）技术。,三、主要方法： 1、HLA血清学分型。 2、常规PCR-SSP反应。 3、SBT分型法： (1)PCR扩增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自动测序仪测序。 (3)测序数据分析及分型。,结果和讨论,一、进行PCR-SSP法HLA-DRB1位点分型：,4、荧光定量PCR技术原理：,图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比,图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果,图5、SSP分型结果与上述一致,FQ-PCR分型的优点： (1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。 (2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCR后处理的时间，结果更客观。 (3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。,(4)只需在反应前打开离心管一次，即可完成所有的操作，减少了污染的机会，进一步提高了特异性和灵敏性。 (5)本FQ-PCR HLA DRB1配型较常规FQ-PCR减少了合成的荧光探针数量。 (6)可得出起始模板拷贝数定量结果。,基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用,特点： PCR技术一问世，首先就应用于珠蛋白生成障碍性贫血等遗传病的基因诊断。 不但要查特定基因是否存在，而且要查出相应功能基因的缺陷：突变？缺失？插入？倒位？等等。 采用的技术更复杂、多样，与检测病毒、细菌的要求不完全相同。 实验室的验收。,基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用,技术：PCR/凝胶电泳 PCR/RFLP PCR/SSCP PCR/ASO(Allile-specific oligoprobe) PCR/sequencing ASA(Allile-specific Amplification) m-PCR(multiplex PCR) F-Q-PCR(Real-Time PCR),血友病甲基因诊断,刘敬忠，梁燕，王立荣，肖白， 朱章菱，周艳，刘亮，张晶 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所,甲型血友病因子基因倒位的研究及检测新技术：,血友病甲（HA）是常见的X-连锁遗传性出血性疾病，是由于凝血因子（F）基因缺陷所致。约半数重型HA的患者，是由于F基因第22内含子（IVS22）发生基因倒位所致。迄今，国际上检测这种基因倒位都是用Southern印迹杂交技术。虽然这种技术能够准确的查出这种基因倒位，但操作步骤多，流程长，出结果慢，难度大，需要DNA样品量大以及操作放射性同位素标记的探针等。我们从1996年开始在国际上率先研究利用长距离DNA扩增技术（LD-PCR），替代Southern杂交进行F基因倒位的诊断。经过近二年的努力终获成功，并进行了推广应用。主要完成了以下几方面工作：,自行设计合成了长距离PCR的四个引物P、Q、A、B。预期扩增产物长度P/Q为12Kb，A/B为10Kb，P/B及A/Q为11Kb。,四引物及三引物LD-PCR体系的比较,系统优化了引物浓度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO浓度，基因组DNA的质量和用量，退火及延伸温度、时间，低浓度琼脂糖凝胶电泳条件及操作方法等。使10-12Kb DNA扩增及检测倒位终获成功。这充分体现了该成果的科学性和先进性,不同量模板DNA对LD-PCR 的影响 1-5号的DNA量分别为0.25，0.5，0.75，1.0，1.25g,不同量deaza-dNTP对LD-PCR的影响 1-5号dNTP浓度分别为200，300，400，500， 600M,53份重型HA患者及家系成员DNA标本，分别用经典的Southern印迹杂交和本LD-PCR技术在双盲条件下进行F基因倒位检测。两者得出的诊断结论完全一致。表明用LD-PCR技术诊断该基因倒位，检出携带者的特异性和灵敏度均达到百分之百。而且具有操作步骤较简便，需DNA量少，出结果快，不需操作放射性同位素标记探针，在无法取得先症者患儿血样的情况下，也可直接查携带者是否携带倒位基因，如果是可直接做产前诊断等优点。,双盲实验（53份DNA）结果证明：LD-PCR可独立用于重型HA基因倒位的检测,应用实验成功的LD-PCR技术，对来自北京、天津、江苏、湖北、广西、四川、山东、福建等省市的108 个重型HA患者及数目不等的家系成员进行了检测，共查出F基因倒位47例，占44%，与国际上用Southern杂交技术查出的基因倒位引起的HA约占重型HA的40-50%一致。另外，检出30余位倒位基因携带者，为将来开展产前基因诊断，杜绝新的HA患儿出生打下了基础，对优生、提高人口素质有重要意义。,14个DNA标本LD-PCR电泳结果 M：DNA/Hind酶解产物，三条带分别为23.1kb，9.4kb，6.6kb,美国Steve.S.Sommer去年与我们同期发表了一篇类似技术方法的摘要文章。但我们较他们有两个显著不同特点：一是我们强调了运用P、Q和B这三个引物就完全可以满足诊断的需要，省去一个引物A，减少一条10Kb扩增带。这条10Kb带是多余的，且使11Kb及12Kb带出现的难度增大。二是我们研究成功方法后，立即迅速应用于患者及其家系的诊断和携带者检出，现已达一百余家系，产生了很大社会效益和一定的经济效益，并开始向兄弟单位推广应用。,HA8家系 PCR/Bcl酶解分析结果 M: pBR322/Msp；0:-2（酶解前）扩增带长374bp，图中211bp和163bp为酶解后产物 M 3 1 2 1 2 0,HA15家系 St14位点VNTR多态基因连锁分析结果 M: X174/Hae M 12321,HA18家系内含子13（A）和内含子22（B）可变串联重复数目多态性分析结果 A为内含子13中（CA）重复分型结果：-1为21/-，-2为21/20，-2为22/20，-1为21/-，-1为21/21，她是携带者；B为内含子22中（GT）（AG）重复分型结果：-1为26/-，-2为26/26，-2为27/26，-1为26/25，-1为25/- 1 2 2 1 1,血友病乙的基因诊断，携带者检出和产前诊断,刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所,血友病乙的基因诊断，携带者检出和产前诊断,缺失型-地中海贫血基因诊断技术的改进,刘敬忠，周桔，王立荣，周艳 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所,临床诊断,Barts （-/-）,基因型,临床分型,静止型 （-/）,-SEA,-3.7,-4.2,标准型 （-/）,HbH病 （-/-）,问题：PCR技术可重复性差, 难度大， 结果判断复杂， 引物设计有待改进 措施：1、重新设计引物 2、改进和优化PCR反应体系 酶、deaza-dGTP、DMSO、 退火温度、gradient gel等,A B C A B C GE S1 S2 S3 M1 1 2 3 4 5 6 M2 7 8 9 M2 10 11 12 M3,1.2%/2.0%浓度梯度琼脂糖凝胶 1，4，正常（/）；2，5，-3.7/；3，6，-3.7/-SEA；7，/；8，-4.2/；9，12，-4.2/-SEA；10，/；11，-SEA/-SEA；12，9，-4.2/-SEA,1.58Kb,287 bp,173 bp,1.9 Kb,1.7 Kb,根据本试剂盒三个PCR反应产物的电泳图谱作出基因诊断,单管四重PCR试剂盒检测-珠蛋白的基因 三种缺失类型及引物设计示意图,10种DNA的四重PCR图谱,25个海南黎族人DNA的扩增图谱,20个广西、广东-地贫68标本的多重PCR扩增图,根据图谱作出诊断,DNA的提取方法： 盐析法 酚-氯仿抽提法 Chelex快速法,0.8kb质粒灵敏度检测,31例阳性标本 29例阳性标本 60例阴性标本,206bp替代109bp 10-8=33拷贝,灵敏度,206bp标准曲线,灵敏度,灵敏度,436bp试剂盒检测结果,0.2ug 0.1ug 0.05ug 0.02ug 0.01ug,平行性,60例阳性标本及4例阴性标本,1.5kb试剂盒引物优化,1# G / E+2 2# G+2/4.2R 3# G /4.2R 4# G+2/E+2,SYBR-PCR/D.C.技术的优点: RealTime