课件：二蛋白质化学.ppt

第一节 蛋白质概述 第二节 蛋白质的组成单位氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的结构与功能 第五节 蛋白质的性质 第六节 蛋白质的分离纯化和测定,第二章 蛋白质化学,第一节 蛋白质概述,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,二、蛋白质的功能 催化功能 激素功能 运动功能 运输功能 免疫功能,一、蛋白质的定义 蛋白质是由氨基酸以肽键相连而成的生物大分子化合物。,三、 蛋白质的分类（page20-23),1、根据分子形状分类 2、根据功能分类 3、根据组成分类 4、根据溶解度的不同分类 5、根据营养价值不同分类,根据组成分类,简单蛋白(simple protein) 又称为单纯蛋白质，这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链,不含其他成分。,结合蛋白(conjugated protein) 由简单蛋白质与其它非蛋白质成分结合而成。,四、蛋白质的结构组成,1 蛋白质元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 03% 其他 微量,2 蛋白质元素组成的特点 生物体组织中所含的氮，绝大部分存在于蛋白 质中。,蛋白质中氮的百分含量比较恒定，一般平均为16%。,当测出样品中氮的含量后，按照下式就可以计算出蛋白质的含量：,蛋白质含量 = 蛋白氮量 6.25,蛋白质系数,第二节 氨基酸,一、氨基酸的结构,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解产物中分离出来的氨基酸有20种，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,1 除脯氨酸外，与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸。,20种a-氨基酸之间的差别在于它们特殊的侧链结构，即所谓的 R 基团。,结构通式 page 23,2 除甘氨酸以外，所有这些氨基酸的-碳原子上的四个基团都不相同。 A. 氨基酸都具有旋光性。 B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,氨基酸的简写符号,人体所需的八种必需氨基酸,必需氨基酸（essential amino acid）：指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸。,赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 酪氨酸(Tyr) 苯丙氨酸(Phe),按侧链R基团在生理 pH（7.0左右）时的极性性质，20种氨基酸可以分为以下4组：,二、氨基酸的分类,1 非极性R基氨基酸 2 不带电荷的极性R基氨基酸 3 带负电荷的R基氨基酸(酸性氨基酸) 4 带正电荷的R基氨基酸(碱性氨基酸),1 非极性R基氨基酸,2 不带电荷的极性R基氨基酸,3 带负电荷的R基氨基酸(酸性氨基酸),4 带正电荷的R基氨基酸(碱性氨基酸),三、氨基酸的光吸收,参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区（小于220nm）均有光吸收。 在近紫外区域(220-300nm)，只有酪氨酸（275nm)、苯丙氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收光的能力。,四、氨基酸的酸碱化学,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,1 氨基酸的兼性离子形式,2 氨基酸的解离,pH = 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子等电点PI 负离子,酸碱质子理论,pH 小 大,氨基酸解离情况,3 氨基酸的等电点,氨基酸的等电点（pI）：在溶液的某一pH 时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为零，该pH则为这个氨基酸的等电点。某一氨基酸净电荷等于零时的溶液的pH为该氨基酸的等电点。,氨基酸处于等电点时净电荷为零，在电场中没有电泳行为。 等电点时氨基酸的水化能力最弱，因而溶解度最小，可以沉淀析出，以达到分离氨基酸的目的。,2) 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2,Glu （谷氨酸）,中性氨基酸: pI = (pK1 + pK2 )/2,等电点的计算,3) 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,His,在等电点以上的任一pH，氨基酸带净负电荷，在电场中向正极移动。在低于等电点的任一pH，氨基酸带有净正电荷，在电场中向负极移动。 在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点越远，氨基酸所携带的净电荷越大。,自测题,1 有一氨基酸混合液，所含四种氨基酸的等电点分别为4.6、5.3、 6.7、7.5，欲使其中三种在电泳中向阳极泳动。应选择下列哪种pH值的缓冲溶液？ A、5.0 B、6.0 C、7.0 D、8.0,2 已知谷氨酸的三个可解离基团，其pK1=2.6, pK2=4.6, pK3=9.6, 它的等电点应当是多少？ A、3.6 B、7.1 C、6.1 D、4.6,第三节 肽,一、概念 1 肽：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。,二、肽的命名,2 二肽：两分子氨基酸形成的肽 3 三肽: 三个氨基酸缩合成的肽 4 寡肽：含有少于10个氨基酸的肽 5 多肽：由10个以上氨基酸组成的肽 组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 肽单位： 肽链中的酰胺基，也称为肽基。,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln。命名为：丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺。,氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,三、肽键的特点,第四节 蛋白质的结构,一、 蛋白质的一级结构,（一）定义：多肽链中的氨基酸序列，包括二硫键的位置。,（二）蛋白质一级结构的测定,测定蛋白质一级结构的样品要求：,A 样品必需是均一的，纯度应在97%以上 B 知道蛋白质的相对分子质量，并且误差在10%左右,测定步骤：,1 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。如果蛋白质含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数应与末端残基的摩尔数相等；如果后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链组成。,3 二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,2 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质。如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,4 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。 酸水解和碱水解，氨基酸分析仪 5 分析多肽链的N-末端和C-末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,N-末端分析方法,二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法: 即著名的Sanger 反应 (page 34)。DNFB也称Sanger试剂。 丹磺酰氯（DNS）法: 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称，缩写为DNS。此方法原理与DNFB法相同，只是用DNS代替了DNFB试剂。由于丹磺酰基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。,黄色,二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法,肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,C-末端分析方法,6 多肽链断裂成多个肽段，并将其分离开 化学法 (page 37) 溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,水解位点,胰蛋白酶 R1=赖氨酸（Lys）或 精氨酸（Arg）侧链,酶解法,R2 = Pro (抑制水解),水解位点, 糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶),R1=苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）,R2 = Pro (抑制水解),2019/8/27,37,可编辑,水解位点,胃蛋白酶,断裂点两侧的残基都是疏水性氨基酸 special 苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp) 酪氨酸（Tyr）、亮氨酸(Leu）,R1 = Pro (不水解),7 测定每个肽段的氨基酸顺序 Edman（苯异硫氰酸酯，PITC）法,+,+,偶联反应,环化断裂反应,转化反应,PTC-肽,ATZ,PTH-氨基酸 268 nm,减少一个残基的肽,PTC-肽（苯氨基硫甲酰肽） ATZ （噻唑啉酮苯胺） PTH-氨基酸（苯乙内酰硫脲氨基酸）,8 确定肽段在多肽链中的次序,根据下面给出的信息，确定肽链中氨基酸的序列： 1.酸水解得Val，Phe，Gly，Arg，Ile，Met，Thr。 2. Sanger试剂处理得 DNP-Gly。 3. 胰蛋白酶处理得Gly 、Arg、Thr和Ile、Met、Phe、Val；当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Gly 和DNP-Val。 4.溴化氰处理得Gly 、Arg、高丝氨酸内酯、Thr、Val和Ile、 Phe；当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Gly 和DNP-Ile。,自测题,答案：Gly-Thr-Arg-Val-Met-Ile-Phe,（三）蛋白质一级结构与生物学功能,1 蛋白质的一级结构决定其高级结构,一级结构与分子病 镰刀状贫血是由遗传基因的突变导致血红蛋白分子一级结构突变引起的。血红蛋白分子- 链上的第六位谷氨酸被缬氨酸所替代，使血红蛋白分子空间结构发生一些变化。,同源蛋白质：不同种属中执行同一功能的蛋白质。如牛、兔等的血红蛋白都有运输氧的功能。,2 蛋白质的一级结构差异越小，其功能的相似性越大。,3 一级结构上的细微变化可直接影响其功能,定义：蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。 主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。 1 无规则卷曲：是无一定规律的结构，但这些部位往往是蛋白质功能或构象变化的重要区域。,二、蛋白质的二级结构,2 -螺旋,左手和右手螺旋,Page 42,每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，沿螺旋方向上升0.54nm。每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm。 -螺旋结构的稳定主要靠链内的氢键。 大多数蛋白质中存在的-螺旋均为右手螺旋。,3 -折叠（ -折叠片）,由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,平行 反平行,Page 43,4 -转角,弯曲处的第1个氨基酸残基的C=O 和第4个残基的NH之间形成氢键，产生一种很不稳定的环形结构。,在蛋白质中由若干相邻的二级结构组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体。 主要有三种:、。,超二级结构,超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。,结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。,定义：在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。,三、蛋白质的三级结构,肌红蛋白,四、蛋白质的四级结构,四级结构：自然界中很多蛋白质是以独立折叠的球 状蛋白质的聚集体形式存在的。这些球状蛋白质通 过非共价键彼此缔合在一起。缔合形成聚集体的方 式构成蛋白质的四级结构。,亚基：四级结构的蛋白质中每个球状蛋白称为亚基，亚基一般是一条多肽链。 二聚体蛋白: 由两个亚基组成的蛋白。 寡聚蛋白质：由两个或两个以上亚基组成的蛋白质。寡聚蛋白包括许多很重要的酶和转运蛋白。,两个亚基的结构,血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。,血红蛋白,五、维系蛋白质结构的作用力,维系蛋白质分子一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子二级结构：氢键 维系蛋白质分子三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子四级结构：范德华力、盐键,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,第五节 蛋白质的性质,一、蛋白质的两性解离和电泳现象 二、蛋白质的胶体性质 三、蛋白质的沉淀作用 四、蛋白质的变性 五、蛋白质的紫外吸收 六、蛋白质的颜色反应,一、蛋白质的两性解离和电泳现象,当溶液在某一pH时，使蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零，这时溶液的pH称为该蛋白质的等电点（ pI） 在pH大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在pH小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。 在外加电场下，不处于等电点的蛋白质分子向与其电性相反的电极移动，这种现象称为蛋白质电泳。 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。,二、蛋白质的胶体性质,蛋白质的分子量很大，在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的特征，如丁达尔现象，布郎运动，不能透过半透膜以及具有吸附能力等。,透析：透析膜是半透膜，蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。,1 可逆沉淀,三、蛋白质的沉淀作用,2 不可逆沉淀,在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以又称为非变性沉淀。,由于在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质发生了变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等。,四、蛋白质的变性,蛋白质的变性：某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。 引起变性的主要因素：热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,蛋白质变性后，二、三级以上的高级结构发生改变或破坏，但是一级结构没有破坏。,蛋白质的变性都伴随着不可逆沉淀,大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。,五、蛋白质的紫外吸收,六、蛋白质的颜色反应,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸在280nm附近有最大吸收。,利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,1 蛋白质黄色反应：含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色。,2 双缩脲反应,双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应，生成粉红色的复合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键（含有两个或两个以上肽键），因此也能起双缩脲反应。 肽键的反应，肽键越多颜色越深。 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度,第六节 蛋白质的分离和纯化,一、蛋白质的分离步骤 二、蛋白质的纯化方法 三、蛋白质含量的测定,一、蛋白质的分离步骤,1.生物组织的破碎。常用的方法有研磨法、 超声波法、冻融法和酶解法等。,2.选择不同的溶剂进行抽提。,3.粗提: 可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。,4.精制：用层析法、电泳法等进行精制。,5.成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,二、蛋白质的纯化方法, 盐析,1. 沉淀法 通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。,蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被