课件：EG诱导细胞融合.ppt

PEG诱导细胞融合,李卓 王慧琴 杨佳慧 王钟秀,细胞融合,自发条件下或人工诱导下，两个或两个以上的同种基因型或异种基因型的细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合，也称细胞杂交。 同种细胞能够自发融合，是机体重要的生命活动，如有性生殖时配子的融合。 异种细胞的融合必须经过诱导剂处理，进行诱发融合。,细胞融合技术,是指细胞通过诱导和培养，在离体条件下用人工方法使不同种细胞发生膜融合、胞质融合和核融合从而形成杂种细胞，使其同时具有两种细胞的遗传和生物特性。 常用的人工诱导方法包括：病毒诱导法、电刺激法、聚乙二醇诱导法。,细胞融合发展史,自然发生的细胞融合 早在19 世纪人们就发现在自然条件下生物界中有自发的细胞融合现象。Muller 1838 年在肿瘤中观察到了多核细胞此后在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞这些多核细胞可能是病毒作用的结果：但当时还没有人认识到这一点。1875 年Lange 首先观察到脊椎动物蛙类血液细胞合并，继之又有一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合细胞。,2.PEG作为促融剂引起的革命、 由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,科学家们又尝试寻找比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学PEG加拿大华裔科学家高国楠等( 1974 年) 的研究取得重大突破他发现高分子量的聚乙二醇( PEG) 在Ca2 +存在时能促使植物原生质体融合显著提高融合率从而迅速推动了原生质体技术的基础研究和应用研究。至此应用原生质体和发展操纵它们的方法已引起实验生物学的“无声革命”。 ,同时, Pontecorvo ( 1975 年)发现PEG能诱导哺乳动物细胞融合并产生杂交细胞。1976 年Davidson等对此作了进一步证实。以后的研究工作表明, PEG不仅可以促使植物、动物、微生物的细胞融合,而且还能促使动物细胞与植物的原生质体发生融合,促使微生物原生质体与动物细胞融合, 使植物原生质体摄入微生物。1975 年Ahkono报道用PEG将母鸡的红血球细胞和酵母菌的原生质体融合成功1976 年Dudus等报道人的细胞能和胡萝卜的原生质体发生融合。Davey ( 1972 年)和Vasil( 1977 年)用植物原生质体摄取了细菌细胞。,1975 年，在动物体细胞杂交技术的基础上又创立了淋巴细胞杂交瘤技术。同体细胞融合一样, 杂交瘤工作早期使用的促融剂灭活的仙台病毒, 已逐渐为化学促融剂PEG 所取代。Davidson 等于1976年建立的以PEG诱发哺乳类细胞融合的方法, 也同样适用于淋巴细胞同瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术能制备纯度高、专一性强的抗体,适于由未纯化的抗原大量制备,因而在短短几年时间里,即已被广泛用于制备各种单克隆抗体。,PEG诱导细胞融合,PEG作用机制,聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG是一种特殊的脱水剂，可与水借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，使细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。,PEG的最适使用条件,细胞的融合效果与PEG的相对分子质量及其体积分数成正比，但PEG的相对分子质量越大、体积分数越高，对细胞的毒性也就越大。实验时常选用PEG相对分子质量为4000-6000，体积分数为50%时，细胞破碎较少，融合率较高。,其他影响细胞融合的因素,钙离子可以使带微弱负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，引起细胞膜表面电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个细胞全部融合。当钙离子浓度为50mmol/ml时，融合效果最好。,实验结果： 观察到两个或多个 细胞发生质膜融合 但核尚未融合，有 的则是细胞间不仅 发生质膜融合，而 且细胞核也发生了 融合。,刚开始融合,开始进行核融合,分析讨论,聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。 由实验结果可得，鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率还是不错的。经分析主要是以下原因： 由于PEG与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜， PEG与鸡血红细胞充分接触，从而融合率比较高。,实验注意事项：,1. 由于离心时红细胞的数量很少，吸取的时候要小心，尽量把吸附在管壁上的红细胞都吸出来。此外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的分层。 2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或者细胞膜破裂导致细胞质外泄。 3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚融合的细胞分开。 4. 加PEG应该在37C水浴加，这样可以防止PEG凝固，导致离心失败。 5. 注意每次离心的时间和速度，否则得不到想要的红细胞。,新的细胞融合方法,细胞融合技术在生物科学各领域取得进展的同时,从事细胞融合研究的科学工作者一直没有放弃寻找具有更高融合效率的方法。虽然用PEG 作介质诱导细胞融合具有上述优点,但PEG 诱导细胞融合也存在一些内在的问题,如PEG 在有效的浓度范围内( 50 % 55 % )对细胞毒性很大,因此人们又试图寻找新的方法来替代PEG 介导细胞融合法。,电脉冲诱导细胞融合技术 激光融合技术 空间细胞融合技术 离子束细胞融合技术 非对称细胞融合技术 纵观细胞融合技术的发展历史, 细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上, 另一方面体现在新方法上, 再者体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒,灭活病毒生物阶段到PEG 化学物质阶段; 新方法不断涌现, 从生物学, 化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生物,从种内扩展到种间, 从近缘扩展到远缘。每一次技术上的更新和改进都会带来应用上的巨大革命和创新, 达到为人类服务的目的。,细胞融合技术的应用及发展前景,从细胞融合技术发展的历程可以看到, 伴随着细胞融合技术的每一次革新和改进, 都会迅速在各个领域得到充分的应用, 然后在实际应用中又不断发现新的问题,在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶, 使其日臻完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药