课件：三蛋白质的修饰和表达.ppt

1,第三章 蛋白质的修饰和表达,第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达,2,第一节 蛋白质的化学修饰,一、蛋白质侧链基团的化学修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 四、蛋白质的化学交联和化学偶联,3,一、蛋白质侧链基团的化学修饰,修饰部位：蛋白质的侧链基团,修饰机制：选择性的试剂或者亲和标记试剂与 侧链上的特定功能团发生化学反应,修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键,4,（一）巯基的修饰,特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团 修饰试剂 反应类型 烷基化试剂 羧甲基化 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺 光吸收 DTNB 二硫键、 有颜色的TNB,5,（二、氨基的化学修饰）,特点：亲和反应活性高 赖氨酸的 氨基 修饰试剂 反应类型 TNBS 黄色复合物（420nm） 烷基化试剂 （卤代乙酸、芳基卤、芳族磺酸） 磷酸吡哆醛 光吸收,6,（三）羧基的化学修饰,由于羧基在水溶液中的化学性质使蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，最广泛，可在较温和的条件进行,7,（四）二硫键的化学修饰,修饰方法：还原 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。,8,化学修饰影响条件,1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件； 2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态； 3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。,9,二、蛋白质的位点专一性修饰,特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性 类型 特点 应用 亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体 不可逆 光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点 不可逆 鉴别蛋白质 光反应基团,10,三、蛋白质的聚乙二醇修饰,PEG特点：亲水、不带电荷 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免疫反应和酶的水解 修饰方式：活化-OH（剧烈条件） 偶连基团：氨基、巯基、羧基 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、酶降解作用降低 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶 PEG 修饰脂质体包被的阿霉素,?,11,四、蛋白质的化学交联和化学偶联,交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。,偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。,12,蛋白质的化学交联,13,蛋白质的化学交联,14,蛋白质分子固定示意图,15,16,第二节 蛋白质的分子生物学改造,基因突变 定点突变 定向进化 基因融合,17,限制性内切酶,外源DNA,限制性内切酶,退火,重组质粒,转化,受体细胞,筛选,表达,带重组体的细胞,目的产物,质粒,一、目的基因的获得,目的基因,二、重组,三、重组体转入受体细胞,四、筛选和鉴定接受了重组体的细胞,五、外源基因在受体细胞内表达,18,（一）定点突变,定义：改变一个或两个碱基 特点：突变率高、简单易行、重复性好 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清除率，延长血浆半衰期,19,1、重叠延伸PCR技术,20,重 叠 延 伸 PCR 介 导 的 定 点 突 变,21,2、快速定点突变,22,限制性内切酶,外源DNA,限制性内切酶,退火,重组质粒,转化,受体细胞,筛选,表达,质粒,目的基因,酶切割,蛋白基因,新突变质粒,23,酶切割,蛋白基因,新突变质粒,同时获得多个突变体,盒 式 突 变,24,（二）定向进化（directed evolution）,范围：特定的蛋白质 条件：大量突变体、合适的筛选系统,25,1、制造突变体,易错PCR原理： 改变正常PCR反应体系 中某些组分的数量或者 质量，随即引入错误碱 基创造序列多样性的 DNA文库。 难点：适当的突变频率,DNA改组技术原理： 靶基因酶切产生随机DNA 片段，以3-末端的片端为 引物和模板，随机互补结 合并延伸。 优点：突变率高、 适用不同物种,方法：易错PCR、DNA改组技术,26,2、筛选,方法：表型观察选择、高通量筛选 （1）噬菌体表面展示技术 概念：外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合存于噬菌体表面的技术 特点：基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,27,噬菌体展示技术的基本原理,28,（2）核糖体展示技术 原理：,该技术是基于一种稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的构象基础。抗体蛋白与它的编码序列物理连接。抗体基因转录，产生许多mRNA分子，每一个代表着不同抗体基因。mRNA分子与细菌的核糖体孵育，然后mRNA翻译成蛋白质。每个复合体展示一种不同的抗体，当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后，一些能结合上去的复合体不会被洗去，该展示技术完全在体外完成，并且不需要克隆就能完成大规模抗体库的构建。,29,二、基因的融合,概念：不同的基因或者基因片段序列构成一个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后，获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功能蛋白。,原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者多肽基因，实现两个基因的融合表达,30,基因融合的策略,1、方法 将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当的信号肽之后； 在目的基因的两端分别加上不同的亲和标签； 将目标基因插入到信号肽序列和插入序列之间 2、影响基因融合的因素： 融合蛋白接头的设计和选择 构建融合蛋白的常用技术 3、 主要应用 利用其生物学功能 利用其与受体结合的特异性，构建导向药物,问题？,31,第三节 重组蛋白质的表达,依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达体系：大肠杆菌 真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,32,常见的克隆载体：,质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等克隆载体(cloning vector),33,一、目标蛋白质在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌表达体系优越性： 1、对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解； 2、是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3、许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4、大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。,34,大肠杆菌中表达体系的不足： 1、真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2、真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3、真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。 4、许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； 5、细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。,35,（一）表达载体的构建（组成）,1、复制的起始点 2、选择性基因 3、启动子 4、核糖体结合位点 5、多克隆位点 6、转录终止序列,R：调节序列；P：启动子； SD：SD序列；TT：转录终止序列,36,Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子,1. 启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNA聚合酶所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种,37,2. SD序列提供核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点（ribosome binding site）的存在。SD序列（Shine-Dalgarno sequence）位于转录起始位点上游813 bp处，为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体30S小亚基中的16S rRNA 3端的部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。,38,3. 转录终止序列有助于外源基因的高效表达 尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中都带有转录终止序列。 转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达几百bp。 转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外源基因，控制所转录RNA的长度，提高RNA稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。,39,利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定,无启动子的CAT质粒载体,Ecoli DNA,构建Ecoli基因文库,细胞裂解物、 14C标记得氯霉素 乙酰辅酶A,薄层层析 放射自显影,CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发生乙酰化作用。,40,载体上有-半乳糖苷酶N端编码序列， 细菌染色体DNA有-半乳糖苷酶C端编码序列,-互补（蓝-白筛选）,41,常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体,42,Trp启动子的表达载体,组成： 1、大肠杆菌染色体DNA的5.4kb Hind 片断， 含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。 2、将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。 3、Hind部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经核酸外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.,43,（二）在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素,1、启动子结构对表达效率的影响 能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上。 呈现低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。 诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。,44,2、转录终止区对外源基因表达效率产生影响 3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率 的影响 4、密码子偏好性,45,5、表达定位 根据外源蛋白在细胞内外的位置分为： 胞内 胞质膜 胞周质 外膜 胞外培养基,46,1、形成包涵体 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害 2、蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。 3、表达的质粒载体构建比较简单。,表达的外源蛋白定位在胞内 优点：,47,1、包涵体 a 蛋白质发生折叠，再折叠的蛋白质可能无法恢复 其生物学活性 b 蛋白质的终产量偏低 c 蛋白质的生产成本比较昂贵 2、还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统） 3、由于N末端存在甲硫氨酸，影响蛋白质的真实性 4、 蛋白质会被酶解 5、蛋白质种类多，因此纯化比较复杂,表达的外源蛋白定位在胞内 缺点：,48,细胞外周质表达,周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 特点：在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。,49,优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境） 4. 蛋白质的N末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割 缺点： 1. 信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2. 有可能形成包涵体,细胞外周质表达,50,途径： 1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。 （可以分离到中等产量的蛋白质）,细胞外分泌,51,优点： 1、蛋白质的酶解作用程度低 2、由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标 蛋白容易纯化 3、增进了蛋白质的折叠作用 4、蛋白质N-末端的结构真实 缺点： 1、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的 2、由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂,细胞外分泌,52,二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达,酵母表达体系是最为成熟的真核细胞表达体系 特点： 酵母是最简单的真核生物，其在某些方面与原核细胞类似，繁殖速度快，培养和发酵等操作也较为简单，利于工业化生产； 多种酵母的遗传背景较清楚，基因表达调控机制研究得较为透彻； 酵母具有真核细胞的特点，能识别内含子，能对蛋白质进行一定程度地翻译后修饰，并且有分泌功能，从而方便了蛋白的纯化； 不产生毒素，安全性较好 。,53,毕赤酵母为甲醇型酵母（即能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长），毕赤酵母表达体系具有如下优势：,诱导型强启动子A