课件：重组DNA技术之表达系统.ppt

重组DNA表达系统 天津科技大学生物工程学院 罗学刚,体外表达：无细胞表达系统 原核表达系统：大肠杆菌表达系统等 体内表达： 酵母表达系统 真核表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 动物/植物表达系统（转基因动物/植物）,体系选择,研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物,一、体外表达系统（无细胞表达系统）,体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统。 优点：内源型mRNA干扰很小，操作程序简单，获得重组蛋白周期很短。主要用于蛋白质快速分析鉴定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互作用的研究。 缺点： 昂贵； 操作要求高； 表达量不够高。,主要的体外表达系统： 1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备。 2、麦胚提取物系统，可稳定地表达一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制的DNA。 3、原核体外翻译系统（S30原核体外翻译系统）， E.coli S30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性。,目前多家公司有商业化产品，常见的有： RTS E.Coli 系统; RTS100 wheat germ CECF系统 (Roche) TNT快速偶联转录/翻译系统 (Promega)； Gold TNT T7 Express 96系统 （Promega），该系统有SP6和T7两种类型，适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析； TNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的TNT T7快速系统从PCR反应液中直接取样，无需纯化DNA，直接用于偶联的转录/翻译反应； TNT 偶联小麦胚芽抽提系统 (promega)。,二、原核表达系统,特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低。 缺点： 翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等 一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在，不具有生物学活性。,（一）大肠杆菌表达系统,目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25以上。 T7RNA聚合酶来源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌RNA聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止 它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增 正常大肠杆菌并不表达T7RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株 常用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等 还有受温度变化诱导的具有噬菌体PL启动子调控 的载体等。,按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表达载体分类,常见的大肠杆菌商业化表达系统有： 1、pET system and pETBlue system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。 基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等 有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同质粒。也可以表达非分泌性蛋白 2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。,pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型),常用表达载体,pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs),BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体 M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体 BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达,特殊的表达用菌株,外源基因在原核细胞中的表达形式,按表达蛋白的部位分： 分泌表达； 外周质及膜上表达 ； 胞内表达。,外源基因在原核细胞中的表达形式,在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型、非融合型。 原则上应能够使外源基因表达效率高，蛋白质产量高，不易被细菌分解，而且产物易被提取、纯化。,融合基因的表达,外源基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为融合蛋白，也就是说要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游，蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由外源DNA的完整序列编码，这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。,融合蛋白的特点,转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白； 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定； 产生的融合蛋白较大，容易从蛋白质凝胶电泳中区别出夹，而且融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻于燥，磨成粉末后即可作为抗原； 有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外。这有助于蛋白质的分离和纯化。,融合方式,6His Tag融合 半乳糖苷酶融合 trpE融合蛋白 谷胱甘肽S转移酶（GST）融合 硫氧还蛋白（Trx）融合 麦芽糖结合蛋白（MBP）融合 碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列,Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin *帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫键的形成与 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG) HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL),各种用于抗体识别的标记,如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达; 如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好; 如果希望表达的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达,采用MBD融合 采用GST融合 采用CBD融合 采用thioredoxin融合 采用Origami等宿主菌 降低菌体培养的速度 温度 (15-30), 降低转速,让表达产物可溶化,采用CBD融合 (pET36/37) 采用Dsb融合 (pET39/40) 采用带pelB/ompT引导肽的载体 (pET12/20/22) 采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) 采用带SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,融合表达的蛋白，在分离纯化过程中往往需要去除表达时额外引入的融合片段。因此需要用不同方法将其裂解，通常有： 1、化学裂解法：特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基。但化学裂解法裂解位点的特异性低，有时可能对目标蛋白产生不必要修饰 如：甲酸、溴化氰等 2、酶解法：反应条件温和，具有高度的特异性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。但酶解法成本高 ，反应时间长，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。,DTT: intein的Cys 溴化氰: Met Thrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGR Enterokinase: DDDDK PreScissionTM protease: LEVLFQGP Genenase I TM PGAAHY TEV protease: ENLYFQ G,融合蛋白的专一性切割,3、IMPACT系统(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 该系统是由枯草杆菌来源的几丁质结合域（5kD，chitin binding domain，用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件 intein组成一个双效的融合标签。 intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，释放出与之相连的目的蛋白。因此融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusion tag的精确切割。但含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统。,分泌型表达,为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解。或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。,分泌型载体的优点,一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定； 一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠； 产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。,蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素： 有一段信号肽； 在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列； 细胞内有相应的转运机制。,信号肽长度一般为1530个氨基酸残基 真核生物和原核生物的信号肽在结构上都有以下特征： 信号肽一般都不长，在氨基末端有一段带正电荷的氨基酸序列，往往是精氨酸或赖氨酸残基，其数目为13个； 有一个高度疏水的核心区，含亮氨酸或异亮氨酸残基，位置可以从带正电荷的氨基酸延伸到含切割位点的区域； 含有能被信号肽酶水解的切割位点，这个位点常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或丝氨酸之后,分泌型载体也有缺点，例如目的蛋白质的产量往往很低，以及信号肽不能被切除或切在错误位置上等。,非融合蛋白的表达,指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白质mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。 优点：表达产物的生物学功能接近于生物体内天然蛋白质。 缺点：容易被细菌蛋白酶破坏。,包含体（包涵体）,表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内与细菌杂蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合体即包含体（inclusion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体 生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，影响了多肽链的正确折叠，导致疏水基团外露等。,包含体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且非常有利于分离表达产物。但包含体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。,包含体的制备可通过常规方法如超声波、匀浆等使菌体破碎后，离心就可得到。密度梯度离心后则可得到高纯度的包含体 包含体通常不溶于水，加入强蛋白质变性剂后方可溶解 根据包含体中蛋白质种类的不同，通常用68molL盐酸胍或910molL尿素溶解包含体。采用pH 2045的酸性溶液也可使包含体溶解。,形成包含体的表达蛋白恢复其活性的过程称为包含体蛋白质复性 其基本原理是随着变性剂浓度的降低，表达蛋白恢复其天然构型 常用的复性方法有逐步稀释法或透析法等。,透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀) 快速稀释法: 最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀) 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度 凝胶过滤法: 快速, 可重复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点 亲和层析复性法, 水相二相法, etc,包含体来源蛋白质的复性,（二）枯草芽孢杆菌表达系统,Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展 枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株 A.芽孢杆菌的分类除枯草杆菌外，已报导用作宿主表达克隆基因的有：嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种 B.枯草芽孢杆菌168的基因组序列测定已完成,芽孢杆菌表达系统的优点-相对于大肠杆菌 1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害 2、转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA 3、质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体 4、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的 5、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。例如：淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等 与革兰氏阴性（大肠杆菌）相比，阳性菌（芽孢杆菌）简单的细胞壁结构赋予了它高效地向胞外分泌目的蛋白的能力,这样从而使得目的蛋白的纯化相对比较简单 芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统。可完成目的蛋白的高效分泌表达，从而避免包涵体形成 6、良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度,芽孢杆菌的缺点如下： 1、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。 2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低 3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。,芽孢杆菌常用的宿主 已报导用作宿主表达克隆基因的有Brevibacillus brevis（短短芽孢杆菌）、嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等 短短芽孢杆菌作为表达菌株的几个优点： 1、几乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢杆菌至少分泌8种不同的蛋白酶），利于目的蛋白的稳定性 2、细胞壁相对于枯草杆菌来讲更薄，有利于外源蛋白的分泌 3、据研究其发酵液中存在着可以促进蛋白中二硫键形成的因子，可以促进外源蛋白的折叠,载体： 目前，芽孢杆菌中常用的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种 从芽孢杆菌中分离的自主复制质粒，除极少数以外（例如pBC16），均为无抗性标志的隐秘质粒 带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它G+细菌，特别是来自金黄色葡萄球菌的质粒。其中广泛使用的有pUB110、pC194和pE194等。迄今 已在上述质粒的基础上构建了双标记质粒、芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭质粒、表达质粒、整合质粒和探针质粒等,绝大多数的载体在阳性菌中的拷贝数都非常低。采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的一个有效的途径 整合的目的一般通过同源重组或者转座子插入来实现。这种质粒的基本结构是在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。 它在大肠杆菌中进行基因克隆或亚克隆操作。整合质粒导入芽孢杆菌后，由于它没有芽孢杆菌质粒的复制起点而不能自主复制，只有插入到宿主体后，随着细胞复制而复制。在含有整合质粒中芽孢杆菌抗性标志的抗生素的培养基上，就可以很容易挑出这种整合体 整合质粒另一个重要的用途是用于目的基因的敲除。不少噬菌体都可用作载体，如105噬菌体，SP噬菌体及其它噬菌体。其中 105噬菌体应用较多，它是一个温和噬菌体，基因组约为39.2Kb，从中发展了不少载体。目的基因一般在体外“包装”之后，经噬菌体介导（转导）而进入宿主菌进行表达,其 他,乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis),三、真核表达系统,（一）酵母表达系统,优点： 1、基因背景了解清楚，上游操作简单，生长迅速，非常适于大规模发酵。 2、具有一定的加工及修饰能力：如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工。表达产物与天然蛋白相同或类似。 3、可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰，但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同。 4、可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。,缺点： 产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性等； 糖基化修饰与高等真核细胞并不相同。,载体：均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。有附加体型载体和整合体型载体两种。常用启动子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1 等。 酵母表达系统载体有： 1、整合型载体: 导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但基因拷贝数低。 2、附加体型载体：在酵母宿主中拷贝数量大，但在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。,常见宿主有：酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母等。 酿酒酵母表达系统多为附加型载体，巴氏毕赤酵母，多形汉逊酵母表达系统为整合型载体。克鲁维酵母表达系统则兼而有之 酿酒酵母表达系统缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达质粒易于丢失 目前，毕赤酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统 它以甲醇作为唯一的碳源。产量较高。翻译后的加工更接近哺乳动物 。如日本绿十字公司利用该系统可以达到公斤级水平的人血清白蛋白的生产。,商品化酵母表达系统有毕赤酵母（Pichia）系统 （invitrogen）和Saccharomyces酿酒酵母表达系统（invitrogen） 毕赤酵母系统重组蛋白表达量可高达12 g /L，表达量最高。,（二）昆虫细胞表达系统,昆虫细胞表达系统是以杆状病毒为载体，昆虫细胞为宿主的表达系统。 1、表达效率高。重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50。 2、属于真核表达系统。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表达产物形成天然的高级结构，保持原有的生物活性与功能。 3、杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。,4、杆状病毒属于昆虫病毒。具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。病毒重组因失去多角体保护，在自然界的生存能力很弱，因此比较安全。 5、应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因可表达毒性蛋白。 6、杆状病毒表达载体通用性广。可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。 7、重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表达外源蛋白。,缺点： 宿主细胞生长慢 培养基昂贵 含有免疫宿主蛋白、 杆状病毒感染会导致宿主死亡、因此每一轮蛋白合成均需重新感染 昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异，其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构。,启动子采用多角体蛋白启动子。宿主细胞通常来源于双翅目昆虫，包括果蝇、蚊子。来源于草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf9细胞系是最常用的宿主细胞。 商品化系统： BaculoDirect 杆状病毒表达系统（invitrogen），典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。 DES-Drosophila expression system 结合了昆虫细胞高表达水平和哺乳动物细胞的稳定表达的优点。,（三）哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。,但该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，基因工程单抗等。 CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋白生产的首选体系。,载体： 1、病毒性载体系统，包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体。 优点：能够高效导入外源基因。 缺点：包装时对其基因组的长度有严格的限制，插入外源基因一般较短。 2、质粒性载体系统。 优点：适用于多种细胞；安全。 缺点：导入外源基因的效率不如逆转录病毒。,商品化系统： ViraPower慢病毒表达系统，是第一次实现在不分裂的哺乳动物细胞中进行稳定的高水平基因表达。 Adeno-X 表达系统最有效的腺病毒系统之一。BD Adeno-X Expression System (Clontech)可以在2周内获得高效价的腺病毒，其效率远高于其他腺病毒系统。 BD Adeno-X Tet-On & Adeno-X Tet-Off Expression Systems (Clontech) 可表达毒性蛋白质。BD RevTet-On & RevTet-Off Gene Expression Systems (Clontech) 表达效率高。,新霉素抗性选择系统,新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，而真核细胞核糖体则不受新霉索的影响。新霉素的一种类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。,细菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核细胞表达。neor基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当细胞表达了这种neo抗性基因后就会在含有G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。,外源基因导入哺乳动物细胞,目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。,转染方法,（一）质粒为载体的物理化学转染法 （二）以病毒为载体的生物学转染法,磷酸钙法,其利用的基本现象是：DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力，但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。,脂质体,近年来用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体（Liposome）可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效，现有商售的脂质体试剂，使用日益广泛。,显微注射法,是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。,电穿孔转染法（electroporation）,用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率。,以病毒为载体的生物学转染法,将目的基因插入病毒载体，在病毒调控元件作用下进行表达。作为运载工具的病毒有SV40，人腺病毒，牛乳头瘤病毒，逆转录病毒等。,外源基因在真核细胞中的表达方式,常用的表达方式有两大类： 1、瞬时表达 2、稳定表达系统,瞬时表达系统,瞬时表达的效率取决于吸收DNA的细胞数、基因拷贝数和基因的表达水平，在瞬时表达系统中，吸收DNA的细胞数约为5%50%。因为没有整合，随着细胞的生长，细胞群体中外源基因的含量逐步减少，最后消失。因此瞬时表达系统只能使用数天。,瞬时表达常用于下列方面：根据表达活性确证分离到的基因；研究诱变对蛋白质活性和功能的影响；分离cDNA文库中的基因。这种系统的缺点是不能大量繁殖能产生特异蛋白质的细胞，故不能获得大量的蛋白质(1mg)，也不能用于研究在特定条件下才能表达的基因。,稳定表达系统,如果在转染DNA后进行筛选。则可能得到外源基因整合到染色体中的稳定表达的细胞。不同品系的细胞转染和整合DNA的能力不同，而在筛选获得稳定表达的细胞过程中，整合的能力比转染的能力更重要。,（四）转基因植物,与微生物和动物生物生物反应器相比,植物生物反应器有不可替代的优越性 1.生产成本较低,易于大规模工业生产。植物能进行光合作用,仅需要来自土壤的矿物质和水分便可在适宜的条件下获得大量人们所需的转基因产物 2.植物细胞具有全能性,易于获得再生植株,遗传操作相对简单,培养周期较短 3.转基因植物通过自交得到的后代遗传性状稳定,从而可以在植物体内积累多基因 4.产物贮藏在种子、果实和块茎中便于贮运,其中那些能直接食用的植物疫苗不需特殊贮存条件,5.无毒副作用,安全性好 细菌作为生物反应器时,不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工,而且本身可能是人类病原物 动物作为生物反应器时,在细胞培养过程中可能感染上动物病毒而对人类健康造成潜在危害 植物作为生物反应器被认为是相对安全的,因为植物体只表达病原菌的部分免疫蛋白,不含致病微生物或潜在的致病微生物,对人蓄安全,大大提高了表达产物的生物安全性 6.植物中的蛋白加工途径相对保守,表达产物能进行正确的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻译后加工过程,因此表达产物具有与高等动物细胞一样的免疫原性和生物活性,植物转基因主要方法 农杆菌导入法 这种方法是将农杆菌与植物细胞共同培养 , 用农杆菌整合的目的基因的质粒去转化植物细胞 , 然后通过组织培养 , 获得转基因植株 基因枪法 这种方法用表面附着DNA分子 (含目的基因) 的金属微粒 , 经过加速装置 , 轰击植物细胞 , 将DNA直接射入植物带壁的细胞 , 转化率可达 8 %10 %。这种方法不受受体种类限制 ,快速简单 , 但设备昂贵 花粉管通道法 将目的基因整合后 , 在植株开化时利用花粉管通道直接导入受体植株。这是我国科学工作者发明的方法 , 主要用于棉花转基因研究。,转基因植物在医药中的应用 疫苗 药用蛋白,转基因植物表达体系的问题及解决方案,1、外源蛋白表达量低 蛋白质靶向定位 定位到合适的亚细胞部位，如细胞质、内质网腔、叶绿体、液泡等。外源基因整合到叶绿体基因组后表达量最大可达到叶片可溶性蛋白的46.1% 对外源基因进行优化 使用植物偏好密码子 优化前导肽序列，取出mRNA中不稳定序列和无效抑制序列，并同时表达有助于正确折叠的酶或蛋白质，如分子伴侣等 合理选择启动子并加以改造 使用增强子序列，利用组织特异性的启动子，或者人工构建复合式启动子 如与花椰菜花叶病毒35S启动子相比，增强型双35S启动子可以使外源基因转录效率高出10倍,使用核基质附着区MAR序列 利用染色质高级结构的特点，将MAR连接于外源基因两侧，可使外源基因称为一独立的转录单元，减少周边序列的影响。即可避免外源基因表达的位置效应，又可提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平 使用植物病毒表达载体 病毒载体在宿主细胞中能够反复复制且繁殖速度快，可使外源基因在短时间内大量积累并高效表达,2、下游加工成本高 对基因表达产物进行提纯费用较高 合理选择受体系统，如将外源基因整合到直接是用的植物中或植物的可食器官即可避免或部分避免表达产物的加工 如香蕉：易消化、口感好，且在热带和亚热带常年生长，是食用疫苗的理想宿主 3、安全性问题 植物种类的安全性，如烟草的烟碱污染 外源基因对生态环境的影响,（五）转基因动物技术及其新药研发中的应用,转基因动物技术始于80年代初，所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。近十年来，转基因动物研究发展十分迅速，已先后建立了许多整合有外源基因的转基因小鼠和大鼠，转基因鱼、兔、猪、羊、牛等也已诞生。 由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响，因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认为遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。,一、转基因动物的技术研究,步骤： 构建功能基因 转移 生殖细胞 假孕母体发育 表型分析 转基因动物,方法：,原核DNA显微注射法(Pronuclear DNA microinjection) 多能性干细胞法（Pluripotent stem cells） 病毒载体法（viral vectors） 精子介导的基因转移法（Sperm-mediated gene transfer） 核转移法（nuclear transfer）,1.原核显微注射法,原核显微注射法优缺点：,优点： 1.整合效率高； 2.外源基因长度可达数百Kb； 3.直接获得纯系动物，实验周期相对较短。 缺点： 1.设备昂贵、操作复杂； 2.随机整合、拷贝数无法控制； 3.常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。,2多能性干细胞法,主要是胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC），是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。在适当的条件下可参与胚胎构成，从而产生嵌合体动物。 ESC法是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA定向整合到内源基因组中表达。,胚胎干细胞法的优缺点：,优点： 在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型； 用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。,缺点： 许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因，须进一步杂交才能获得转基因动物。,3病毒载体法,将目的基因以RNA分子的形式重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。然后在逆转录整合酶和逆转录病毒基因组末端的特异性核酸序列的作用下，目的基因将被反转录并整合到宿主基因组中去。,病毒载体法优缺点：,优点： 1.目的基因呈单一位点单拷贝整合、整合率高 ； 2.插入位点克隆分析较容易 ； 缺点： 1.不安全； 2.转入基因的承载能力有限，一般小于10Kb ； 3.所得转基因动物的嵌合性很高，建立转基因系需要广泛的杂交 ； 4.逆转录病毒基因组两侧的长末端重复序列（longterminal repeats, LTRs）会影响哺乳动物的启动子或引起错误表达，其甲基化状态常使转基因的表达缺失,4精子介导的基因转移法,在精子后顶体区域有一种DNA结合蛋白（DBPs），它可以介导外源DNA与精子表面结合。受精后外源DNA即可整合于染色体中。 简单、方便，依靠生理受精过程，免去了原核的损伤。 主要有三种方式：胞质内精子注射途径（ICSI）、电转移或脂质体转染途径、睾丸体内转染途径,5核转移法,1996年，Schnieke用人类因子IX（human factor IX）转染绵羊胎儿纤维母细胞，再将转染细胞的细胞核通过核转移得到HF IX转基因绵羊。 将供体细胞核转入到受精卵的胞质或MII期卵母细胞中，供体细胞的核以及胞质成分，包括线粒体等，就都会被转移。后者可能会促使胚胎重构、胎儿发育以及分娩新生个体。,与DNA显微注射法相比：,1.根据具体方案的要求可选择雄性或雌性细胞株； 2.序列的整合和表达在转染后，细胞用于核供体之前就可以检测； 3.转染的细胞可以冻存长期保存； 4.在一个克隆动物体内的所有细胞都含有目的基因，避免了遗传差异性，并确保生殖细胞也转移了目的基因； 5.得到转基因动物的效率比显微注射几乎高一倍。,6. 转基因动物的诱导表达系统,外源基因转入动物体内后，其过量表达常常会对胚胎的发育产生毒性作用甚至致死作用，从而影响了表型的分析甚至无法获得转基因系。 目前发展比较成熟的转基因可诱导表达系统主要有两种18：四环素诱导系统（tet系统）和Cre/loxP重组酶系统。,这两个系统均需要制备两个系列的转基因动物，一个系列表达具有选择性组织特异性启动子调控下的激动子依赖