人禽流感检测结果的解释分析.ppt

,中国人禽流感（H5N1）病例的 实验室诊断及结果分析,2007年流感培训 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 国家流感中心,全球人禽流感（H5N1）病例数,Total number of cases includes number of deaths. WHO reports only laboratory-confirmed cases.,16 August 2007,呼吸道标本的采集 血清标本的采集 组织标本的采集 消化道标本的采集,第一部分 检测标本的采集,人禽流感病例呼吸道标本的采集,鼻拭子 鼻咽拭子 鼻咽吸取物 鼻洗液 咽洗液 气管吸取物 气管肺灌洗液,人禽流感病例呼吸道标本的采集,尽量采集深部呼吸道标本 肺穿刺液 深部吸取液,血清标本的采集,采集急性期和恢复期血清； 急性期血清应该在病人发病后立即采集，一般不要超过7天，如果没有采集到7天内血清，在能够采集的时候立即采集； 恢复期血清在病人发病后2-3周采集，如果病人死亡，在死亡前应采集一份血清； 病人恢复后应定期采集血清； 采集血清时不能少于5ml； 最好采集全血和血清标本。,组织标本的采集,肺活检组织 尸检组织，尸检组织标本应尽可能采集各种器官组织，在采集过程中应尽可能避免交叉污染，每种尸检组织标本可分为两部分，一部分立即用于病毒的分离检测，如果不能马上进行，应该保存于-70oC；另外一部分保存于福尔马林中，用于病理的研究。,消化道标本的采集,粪便标本 特别是有腹泻症状的粪便标本 PBS 或者细胞培养液 加入以下抗菌素和0.5%BSA -氨苄青霉素 (2 x 106 IU/litre) - 链霉素 (200 mg/litre) - 多粘菌素 B (2 x 106 IU/litre) - 庆大霉素 (250 mg/litre) - 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/litre) - 盐酸氧氟沙星 (60 mg/litre), and - sulfamethoxazole (0.2 g/litre),标本的保存和运输,用于病毒分离的标本应保存于4oC,并且立即送往实验室进行接种，如果在48小时内不能进行接种，应该保存于-70oC；标本应避免反复的冻融（降低分离率）； 血清标本可以在4oC保存7天，否则应保存于-20oC； 标本的保存和运输应遵守国家生物安全的相关规定。,任何成功的流感大流行的准备都依赖于对新出现毒株的正确的诊断。 对于可能是A型流感病毒的每个样品最初的实验室检测应该快速并且能够排除其它常见的呼吸道病毒感染。最理想检测方法是24小时内能出结果。,第二部分：H5N1检测方法的建立,符合以下标准之一的病例可以诊断为疑似或可能的H5N1病例 H5N1 病毒分离阳性。 两种不同的引物针对不同的片段检测H5病毒的PCR结果为 阳性。 微量中和实验恢复血清(发病后2-4周)比急性期血清(发病后7日内) H亚型抗体滴度升高4倍或以上， 且恢复期的血清的微量中和抗体滴度在1:80以上。 单份恢复期血清(症状出现后的14天或以后)的微量抗体滴度在1:80或 以上,这以阳性结果采用不同的血清学方法可以验证,如马血球实验凝集抑制实验抗体滴度在1:160 以上或 H5特异的 westerblot 检测结果阳性。,确认人禽流感病例(notify WHO),H5N1病毒的检测方法,2005年以来中国人禽流感病例的实验室诊断结果,2005年以来中国人禽流感病例的实验室诊断结果（续）,RT-PCR技术的建立,临床标本的RT-PCR检测,Real-time PCR 灵敏度检测,临床标本的Real-time PCR检测,Luminex xMAP technology,MDD 对呼吸道病毒的诊断,MDD对流感病毒亚型的鉴别,1号为气管吸取物标本,一临床病例的MDD检测结果,NASBA H5N1 标本的检测结果,NASBA 与Real-time RT-PCR敏感性的比较,NASBA技术的特点,NASBA 技术, 与Real-PCR 方法灵敏度相当。 NASBA 技术操作简便，而且是一种高通量的方法。 与PCR 的产物DNA 分子不同，RNA 分子不易对实验仪器和环境造成污染。,血清学检测方法,HI( HRBC) ELISA SRH MN,HI assay,不同种属 红细胞HI实验的比较,RBC,Serum (USCDC),Serum (CNIC),Chicken,Turkey,Horse,160,160,160,320,5120,5120,H5 HI titer using different red blood cell,Antigen: A/chicken/hunanxiangtan-he/21/2005(H5N1)(provided by HARBIN Veterinary Research Institute ) Serum: HS: Chicken serum from HARBIN Veterinary Research Institute USCDC: goat serum from USCDC,HI(HRBC) assay,使用U型板 4 代替室温孵育。 每次病毒的滴度要回滴 马血球要新鲜采集，一周内使用。,SRH原理示意图,SRH 实验的优化,最适的抗原浓度是常规血凝板滴定 的1000 HAI。 1% agarose。 鸡血球更适合于SRH实验中的溶血圈的产生。,SRH技术的特点,简便、可靠、重复性好、特异性强、敏感性高，不受血清中非特异性抑制素影响。 血清用量少, 并不必进行稀释。 可对大量血清标本进行测定。 一般实验室均可开展，特别适用于我国基层地区。,单扩溶血的特异性对H5N1 患者血清的测定,微量中和实验 (MN）的特点,微量中和实验 是诊断人感染禽流感的最好的血清雪方法。 敏感性高。 特异性强( strain selection) 。 每次实验要设病毒和细胞对照，病毒要回滴,MN assay of confirmed human cases,第三部分: 检测结果和分析,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by HI assay,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by MN assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay using chicken serum,South China,North China,Viet Nam,Antigenic assay of human H5N1 isolates By MN assay using confirmed human case serum,case1 is a survived confirmed human H5N1 case from Anhui province(southern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset. #Case 2 is a survived confirmed human H5N1 case from Liaoning province(northern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset.,Human H5N1 confirmed cases in mainland of china since Nov,2005,death(15),survival(9),China CDC,Clade 1,Clade2.1,Clade2.3,Clade 2.2,HA Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method using the Mega3.1 program and the boottrap value 1000, the result showing the relationships of HA genes of representative influenza A H5N1 virus from different regions. The red dots denote viruses isolated from humans in China; green dots denote viruses isolated from Viet Nam and were recommended as vaccine strains by the WHO.,NA,PB2,PB1,NP,NS,PA,M,Receptor Specificity (HA 226-228),Drug surveillance (M2 inhibitor drugs),Drug surveillance ( NA inhibitor drugs),HA connecting peptide,WHO recommended candidate H5N1 vaccine viruses for potential use as pre-pandemic vaccines,A/Hongkong/213/03 A/Vietnam/1194/04 A/Vietnam/1203/04 A/Indonesia/5/2005 A/BHG/QH/1A/2005 A/WPS/Mongolia/244/2005 A/Turkey/Turkey/1/2005 A/AH/1/2005,中国目前流行的人 禽流感病毒的特征,所有的基因序列特征均是禽源的，没有发现禽流感病毒与人流感病毒重组或重配的证据； 所有病毒的受体特异性和血凝素抗原连接肽特性仍然是禽源的，与人流感病毒不同；,中国目前流行的人 禽流感病毒的特征,与我国禽中分离的病毒高度同源，因此推测目前我国人的感染仍然来自于禽及其污染环境中循环的禽流感病毒； 流行毒株的情况远比我们想象的复杂，我国南方和北方流行毒株不同，南方不同的地区流行毒株不同。 所有病毒对神经氨酸酶抑制剂药物如达菲仍然是敏感的，只有2007年一株病毒M2基因分析是对金刚烷胺类药物耐药的，其它毒株还对该类药物敏感。,对疾病预防控制的意义,对检测工作的影响 在检测过程中要充分考虑毒株差异对检测结果的影响。 对疫苗的研制工作的影响 如何选择合适的疫苗株？ 对临床治疗的影响 烷胺类药物和神经氨酸酶抑制类药物从目前的结果看来是有效的,建立检测方法的质量控制体系,与中国药品生物制品检定所合作建立以下参考品 核酸检测阳性参比品的建立 滴定好的病毒：103-10-5TCID50