实验15 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法.ppt

琼脂糖凝胶电泳的 原理和方法,概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。,一、概述,琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的藻胶。,1）琼脂糖： 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。 2）琼脂胶： 一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。,琼脂糖链依靠分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,D-半乳糖,3,6-脱水-L-半乳糖,琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： 1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,二、琼脂糖凝胶的特点,琼脂糖凝胶电泳的缺点： 1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低； 2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制； 3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色； 4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定、DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1g蛋白质就可检出。,三、琼脂糖凝胶电泳的应用,琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。,四、DNA的琼脂糖凝胶电泳,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。,1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 1)DNA分子的大小： DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA几乎具有等量净电荷，因此在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。,在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。,2)琼脂糖的浓度： 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示:,2.核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，简称cccDNA)直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(RmO)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。,3.电泳方法 1)凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。,2)缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5溶液，用时稀释10倍。0.5工作液也可提供足够的缓冲能力。,3)凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，冷却至45-50时灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。 4)样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5% Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。,5)电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4，进行电泳。 6)染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。,五、琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白,原理 血浆脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。,(一)血浆脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE 甘油三酯 （TG） 脂类 ： 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 （CE） 少量糖,（二）分类,1. 按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白 （-位） 前-脂蛋白（2-位） -脂蛋白 （1-位）,2. 按超速离心法分 乳糜微粒 ( 0.96 ) (chylomicron, CM) 极低密度脂蛋白 (0.961.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL),（三）结 构 特 征,pH 8.6 pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。,加样槽 前 ,CM LDL VLDL HDL,+,临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM 前 正常 型 a型 b型 型 型 型,六、操 作,溶 胶,准备胶槽,凝胶冷却至50C，加EB至终浓度0.5g/ml,铺 胶,凝胶凝固后取出梳子,加缓冲液,准备样品,点 样,电 泳,注意观察溴酚蓝染液的迁移,琼脂糖凝胶中DNA的观察,溴化乙锭（EB）DNA：紫外光下 红色荧光,紫外灯下观察电泳结果,照 相,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。,实验原理,一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法,DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,二、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一