海洋微藻培养技术的研究进展08051122赵飞.doc

天津科技大学学年论文海洋微藻培养技术的研究进展学院：海洋学院班级：080511学号：08051122姓名：赵飞指导老师：曹春晖日期：2011-12-10摘要：海洋微藻不仅富含蛋白质、脂肪和碳水化合物这三大类人类所必需的物质，而且还含有各种氨基酸、维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其它多种生物活性物质。近年来丰富的海洋微藻资源成为人们探讨的热点，海洋微藻的培养技术已经引起了国内外学者的广泛关注。本文概括性介绍海洋微藻的主要培养技术，其中包括一、二、三级培养，细胞的固定化培养与光生物反应器培养。关键词：特点 培养条件 培养方式 固定化培养 光生物反应器 技术展望Study of marine microalgae cultivation technology advancesAbstract：Marine microalgae not only rich in protein, fat and carbohydrates necessary for the three categories of human material, but also contains various amino acids, vitamins, antibiotics, high unsaturated fatty acids and other bioactive substances. The rich resources of marine microalgae in recent years become a hot spot of marine microalgae cultivation technology has attracted wide attention from scholars. This general description of the main culture of marine microalgae, including one, two, three training, culture and immobilized cell bioreactor light.Keywords：Features Culture conditions Training methods Immobilized culture Photobioreactor Technology Foresight随着全球性资源短缺压力的日益增加，世界沿海国家都把主要注意力集中于海洋生物的开发利用。由于海洋微藻具有生长速度快、光合效率高、无性繁殖和适应性强等特点，是蛋白质、精细化工和医药开发的重要资源，现已成为世界各国研究的热点1。因此，开发、培养和利用海洋藻类将是长远解决人类食品资源和能源的重要途径。当今人们对微藻的开发和研究进入了一个崭新时期，微藻的培养和产品开发成为新兴的生物技术产业，海洋微藻培养技术也随着人们对微藻认识的加深不断发展。一些发达国家已把细胞工程、基因工程、细胞固定化和生物反应器等为基础的生物技术作为育种手段和优化培养条件，用于微藻类的开发研究，其重点是开发具有高附加值的精细化工产品和医药品2。因此把生物技术与传统的育种技术结合起来，在微藻类的开发中，将产生巨大的社会效益和经济效益。1.微藻的特点微藻是一类光能自养型单细胞生物，能有效地利用光能将H2O、CO2和无机盐转化为有机资源，是地球有机资源的初级生产力，迄今已知的藻类约有3万余种，其中微藻约占70%。从1987年至今，新发现的具有开发价值的药用海洋天然产物已达434种。微藻具备如下特点：（1）具有叶绿体等光合器官, 能有效利用太阳能将H2O、CO2 和无机盐转化为有机化合物。（2）以简单的分裂方式进行繁殖, 细胞生长周期较短, 易于大规模培养。（3）可以用海水、咸水或半咸水培养, 是淡水紧缺、土地贫瘠地区获得有效生物资源的重要途径。（4）富含各种物质，是人类未来食品及油料的重要来源。（5）因独特的生存环境使其能够合成许多结构和生理功能独特的生物活性物质, 特别是经过一定的诱导手段, 利用微藻可以高浓度合成这些具有商业化价值的化合物3。2. 微藻的研究与应用微藻的研究与应用经历以下阶段: 20世纪40年代，德国人试验用硅藻生产可做燃料的脂类；50年代至70年代,许多国家开展小球藻、栅藻、新月藻、螺旋藻等微藻的培养与开发研究，主要用作鱼、虾、贝、蟹育苗中的饵料和生产单细胞蛋白(SCP)；年代后微藻生物技术迅速发展，人们逐渐认识到微藻在进化上的多源性、遗传的多样性。藻细胞中有一些特殊的次级代谢物，而且可以利用其生长繁殖迅速、光能转换率高、对环境适应性强、易于遗传改良的特点进行大规模培养，微藻在各领域的开发应用价值成为人们关注的热点4。目前，人们对海洋微藻的培养和研究已经逐步深入，从宏观、微管等层次不断发展。微藻不但可以作为很多高附加值生物制品的重要来源，同时也是开发转基因产品的优良材料。目前国外已经商业化或正在开发的微藻产品有重要的用途。微藻是海洋药物的重要来源, 其药用价值正日益引起人们的注意。海洋微藻的磺酸化多糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗衰老等多种生物活性, 在临床上显示出越来越广阔的应用前景5。目前，可以从海洋微藻中得到很多有极高价值的药物。例如，从螺旋藻中提取的多糖在抑制肿瘤细胞的生长上有重要的作用。3.微藻的培养技术3.1微藻培养条件培养条件中的营养盐浓度及配比对藻类的代谢活动和生长速率有显著的影响，因此针对不同的藻类应对其施加不同的培养条件以达到最佳培养效果。其他培养条件如培养温度、光照强度等也同样影响着藻类的生长。例如，四川大学伊廷强等人在培养一种底栖舟形藻时发现，当PO43-的浓度为1mg/l，铁盐中铁的浓度为0.5mg/l时，该藻的最适NO3-浓度为5-20mg/l，培养小形舟形藻时，确定出最适氮、磷浓度及配比为18.285：0.279（mg/l，原子浓度）6。此外，烟台大学于贞等人对影响小球藻生长的NaHCO3、NaNO3、KH2PO4、维生素等4种主要营养因素进行了优化,得到以海水为基础的优化培养基配方:NaHCO3 0.10g/L,NaNO3 0.225g/L, KH2PO4 0.005g/L, pH 6.07。因此,营养盐中的碳源、氮源以及其它盐类是制约微藻生长的关键因素。 CO2、pH也是影响藻生长的重要条件。CO2 主要以HCO3-形式被利用；pH是影响培养基中HCO3-在总溶解状态的CO2所占比例的主要因素8, 此外, pH值也会影响光合作用, 并影响培养基中藻细胞对离子的吸收和利用, 以及代谢产物的产生。温度、光照强度、通气量等通过影响小球藻光合作用强度而影响小球藻的生长。例如，浙江海洋学院周洪琪等人研究得出，亚心形扁藻的培养温度为17.9-19.6，青岛大扁藻的培养温度为18.0-28.0，两种扁藻的光照强度均为6000lx；微绿球藻的培养温度为261，光照强度为10000lx, 三种微藻都为24h连续光照9。小球藻的最适合通气量为1.5L/min。3.2微藻培养方式在合适的培养条件下,不同的培养方式对微藻的生长也有不同影响。扰动强度和培养基更新速率均有较大影响。3.2.1扰动强度颜润润等研究了不同扰动强度对铜锈微囊藻和斜生栅藻生长的影响,得出在试验所模拟的扰动强度范围内,较小的扰动有利于藻类的生长和聚集,单独培养的微囊藻和栅藻均在扰动强度为90r/min时藻比增长率最大;当转速大于该值时,随着扰动强度的加大,藻比增长率呈现下降趋势10。3.2.2培养基更新速率在半连续培养下,不同的培养基更新率影响藻的细胞密度,从而影响采收量。存在一个最适的更新率值,使日平均细胞密度最大,从而获得最大的采收量。例如，在光生物反应器中,上海水产大学张登沥等人在培养小球藻时发现，小球藻培养基的最适更新率约为33%,日采收量达6.810-7ml-1。3.3微藻的一、二、三级培养3.3.1微藻的一级培养培养容器为5000ml烧瓶或10000ml、20000ml玻璃瓶在选择生命力旺盛、无污染的藻液进行培养。将藻种上清液缓慢倒入消毒后的玻璃瓶中,根据所扩藻类的不同,在藻液或培养用水中加入相应的硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁、硅酸钠)、乙二胺四乙酸钠、维生素B1、维生素B12等主要营养盐。加水量视藻种密度而定,1:1、1:2或1:3。最后用酒精棉擦拭瓶口,用消毒的滤纸封口,摇匀后,置于光线充足处。室温达24-26,每小时摇动一次。扩种情况依藻类长势情况而定。藻液达10000-20000 ml即可进行二级培养。例如，正常情况下,小球藻培养液呈暗绿色,有沉降性,培养小球藻必须连续充气，最适温度25，光照10000lx。小球藻喜氮，藻液中适当提高氮肥浓度有利于生长。一级培养的小球藻密度可达230万个/ml，而一级培养的金藻密度则可达150万个/ml。3.3.2微藻的二级培养培养容器为国产藻类连续培养机、3 t玻璃钢水槽、塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养。培养用水为煮过的水或50%消毒水加50%煮沸过的水。扩种时,将藻液倒入容器中,用泵将水打入藻液中,加入相应营养盐。接种量1:10-1:20。接种后,玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖,24 h连续充气,日光灯照射。每天视藻液的颜色、浓度、生长情况添加营养盐和培养用水经5-6d即可供三级生产性培养。3.3.3微藻的三级培养培养容器为8 t玻璃钢水槽、水泥池封闭式或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒。培养方法与二级培养相同。接种量据情掌握,但不宜低于1:50。充气量达到藻液翻腾。一般经7 d培养,藻细胞达到一定密度时,即可用于投喂青蛤的D型幼虫、锯缘青蟹的Z1幼体和南美白对虾、日本对虾的蚤状幼体等11。3.4微藻细胞的固定化培养与光生物反应器3.4.1微藻的固定化培养微藻细胞的固定化培养是把微藻细胞固定在藻酸盐凝胶或甲壳素中进行细胞培养。例如，固定化培养使杜氏盐藻甘油分泌增加了80.79%，海洋兰藻生长的氨基酸增加了2倍，其谷氨酸的比率为73%，鱼腥藻的产铵量提高6倍。固定化细胞除可增加次生代谢物质外，还可用于污水处理、种质保存等12。3.4.2微藻培养光生物反应器光生物反应器(photo bioreactor)是指能用于光合微生物及具有光合能力的组织或细胞培养的一类装置,与一般的生物反应器有相似的结构,有光、温度、溶解氧、CO2、pH和营养物质等培养条件的调节与控制系统。藻类尤其是单细胞微藻能有效地利用光能、CO2和无机盐类合成蛋白质、脂肪、碳水化合物、油以及多种高附加值生物活性物质,故目前光生物反应器主要用于微藻的大量和高密度培养。随着人类对微藻的认识不断加深,用于微藻高密度大量培养的光生物反应器受到国内外学者和企业的高度重视,开发和研制新型高效光生物反应器及其在微藻高密度培养方面的应用研究已成为藻类生物技术和微藻生物技术的一个重要组成部分。3.4.2.1开放式光生物反应器开放式光生物反应器即开放池培养系统(open pond culture system),其最突出的优点是构建简单、成本低廉及操作简便,培养技术经过广泛深入的试验,已普遍应用于商业化微藻大规模培养中。但开放式培养过程受光照、温度等自然环境影响较大,并且易被真菌、原生动物和其他藻种污染,同时水分蒸发严重,二氧化碳供给不足,这些因素都将导致藻细胞培养密度偏低、采收成本较高。能适应大池培养的微藻藻种必须是在极端环境下能快速生长的藻种,然而能满足这些条件的藻种目前并不是太多,有许多尝试改进该系统,但还是只能用于螺旋藻、小球藻及盐藻等少数能耐受极端环境的微藻培养。34.2.2密闭式光生物反应器密闭式光生物反应器(closed culture system)即通常所指的光生物反应器,是用透明材料组建的一类生物反应器,除了它们能采集光能外,其它诸多方面与传统的微生物发酵用生物反应器相似。密闭式光合生物反应器培养条件稳定,可无菌操作,容易进行高密度培养,已成为今后的发展方向。目前密闭式反应器有多种形式,如发酵罐式、管式和平板式、柱状气升式等光生物反应器。 Miyamot等对水平设置的管道式光生物反应器进行改进,采用-斜管或螺旋盘管式光生物反应器,并做了大量基础理论和应用研究13。1986年Ramosde Ortega等人首次开发平板式光生物反应器14；许波和王长海首次在国内应用平板式光生物反应器对一种高度合成高不饱和脂肪酸-花生四烯酸的淡水微藻进行了高密度培养研究15。机械搅拌式生物反应器是广泛应用于规模培养微生物的生物反应器,具有技术条件成熟,易于控制等优点,因此可以利用现有发酵技术开展微藻的研究开发工作,国内外许多学者在这方面都做了尝试研究。对于浮式薄膜袋类,最初采用聚乙烯薄膜袋密闭式培养海洋微藻,它有受光面积大、保温性能好、污染机会小、成功率高、成本低、操作简单的优点,在提高藻种的密度和纯度上取得了良好的效果,该反应器在生产性培养中得到应用,但因无法解决薄袋的破损漏水问题,没有得到很好推广。张小葵等人对其进行了改进,采用周长200cm,长度约450cm的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋,两边分别用绳封口,同时各扎入长约10cm,直径6cm的聚乙烯硬管作为出气孔,一端通入3个充气石作充气用,将其漂浮在盛有水的原三级培养池中, 两头出气孔用绳吊起,以防袋口沉入水中16。改进之后具备很多优点:膜袋内外压力均衡,薄膜几乎不受张力,且薄膜袋在水中漂浮,自由度相对较大,因而不仅大大方便了操作,而且有效地解决了塑料薄膜袋的破损漏水问题；藻种分布均匀；具有良好的恒温性能；能直接由密闭培养的一级藻种向三级培养的塑料袋中接种,避免了多次接种操作造成的污染。4.微藻的应用前景4.1应用于能源方面目前全世界面临着能源短缺和环境污染的双重压力。生物柴油作为一种新型替代能源，具有可再生、可生物降解、良好的燃烧排放性能。国内生产生物柴油中所面临的主要问题是原料来源不稳定及供应不足，因此开拓新型油脂资源成为我国未来生物柴油产业发展的瓶颈。微藻具有光合作用效率高、生长周期短、易培养以及含有较高的脂类等特点，而且在中国广阔的沿海、内地水域和盐碱地大规模种植高油藻类，不存在与粮争地的问题，从而不会对粮食作物的生产构成威胁，是很有发展前景的生物柴油原料。微藻还可以吸收并利用工业生产排放出的大量二氧化碳和氮化物，有利于改善环境。4.2应用于食品方面微藻中含有丰富的蛋白质，还含有丰富的维生素、矿物质、不饱和脂肪酸以及生理活性物质等，因此可以将其用做食品的生产原料。目前，研究开发得比较成功的是螺旋藻和小球藻食品，螺旋藻、小球藻等食用微藻含有丰富的蛋白质、各种维生素、生物多糖、多不饱和脂肪酸、叶绿素、类胡萝卜素及矿物质等，故具有优异的营养保健功能，如把小球藻干粉或提取物添加到饮料、醋、糖果中，可起到调味作用；也有人将小球藻粉作为食用色素添加到面包中，改变其外观，将螺旋藻产生的藻胆蛋白作为天然的食用色素添加到冰激凌、糖果、果冻酸乳酪中，不仅增加了口感，而且外形非常美观。4.3应用于医药方面一些科学家用小球藻对多种疾病进行治疗，如贫血、白血球减少、高血压、糖尿病、婴儿营养不良等，都取得一定的疗效。螺旋藻中提取的螺旋藻多糖，具有抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳和抗辐射活性，并能提高肌体免疫能力，可以治疗糖尿病及视觉障碍等多种疾病。微藻中富含的DHA和EPA可用于预防和治疗高血脂所致的动脉粥样硬化、冠心病和舒张血管、抗血小板凝聚作用，EPA和DHA还能增强大脑记忆力，有“脑黄金”的美誉；另外微藻中所富含的胡萝卜素、类胡萝卜素都具有一定的预防和治疗心脑血管疾病的作用。虾青素能通过血脑屏障，保障脑部运动神经细胞和组织功能的正常发挥，并具有增强肌体免疫力、抗衰老和防癌变等功效。4.4应用于饲料方面微藻或以微藻为食的浮游动物(如轮虫)是经济水生动物的天然饵料，这些饵料的有无或优劣已成为决定鱼、虾、贝类人工育苗成败的关键因素之一。由于每种微藻的营养成分不同，而每种水产动物所需的营养成分也不同，因此培养不同的水产动物要选用不同的饵料，水产动物的不同发育阶段，也要选用不同的饵料。如三角褐指藻和小新月菱形藻是贝类幼虫和虾类幼体的良好饵料；纤细角毛藻可以作为双壳贝类、海胆、海参、甲壳类等幼体的饵料；球等鞭金藻可以作为贻贝、扇贝等多种双壳类幼虫、刺参幼虫和对虾幼体的饵料。5.微藻培养技术展望海洋微藻中资源丰富，并且含有许多具有特殊生理功能的生物活性物质，使微藻的养殖和产品开发具有很大的潜力。微藻藻种定向改良和基因工程的研究、培养方式及条件的优化、后续加工工艺的改进等都在提高微藻产品价值和微藻产业效益上发挥着重要作用。微藻的培养、研究和开发虽已取得不少成绩，但就总体而言，研究才刚刚起步，有很多微藻还未触及，微藻种类繁多，生态习性复杂，能天然生产许多不同和稀有的脂类、糖类和生物活性物质等。它们还包括大量的未曾开发利用的一类生物，可有效提供源源不断的产品资源。因此，广泛收集微藻的种质资源是十分必要的。在这方面我国有较好的基础。如青岛海洋大学应用微藻研究室，近十多年来已收集到国内外微藻700多株，大约400余种，其中一些藻种具有重要的经济价值，但这些微藻的研究还很不深入。但随着学科技术的发展, 基础理论研究的深入，微藻培养技术必将得到更多的应用和更大的重视。参考文献:1张建民，刘新宁.海洋微藻的利用现状和开发前景J.齐鲁渔业，2006，23(4):682 王红育，李颖.海藻产品开发现状及应用J食品研究与开发，2008，8(29):1611643 薛彦斌，崔效杰,刘建国.微藻资源的研究和开发J.食品与药品，2005