实验一：鸡血细胞融合.doc

实验一：鸡血细胞融合一、 实验目的1、 熟悉细胞融合的理论；2、 掌握PEG诱导的细胞融合方法。二、 实验原理1、细胞融合原理两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。2、细胞融合方法 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。所有的细胞融合方法都有其各自的优缺点，我们在本次实验中采用PEG诱导细胞融合的方法。三、实验材料和用品1材料： 鸡血红细胞；2器材和仪器：显微镜、离心机、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片；3试剂： Alsever 液(pH7.4)、0.85生理盐水、GKN 液、50PEG四、实验步骤1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4下保存）；2、 取上步中所得悬液1ml+4ml 0.85的NaCl溶液，进以下三次离心处理：1200r/min离心5min（去上清液再加入至5ml的0.85%NaCl溶液）；1000-1200r/min离心5min（去上清液再加入至5ml的0.85%NaCl溶液）；10001200r/min离心7min；3、将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。4、取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000万个，即15107个/ml。5、取步骤4中所得悬液1ml+0.5ml 50%的PEG液，混匀滴片，再常温下2-3min后即可镜下观察。五、实验结果图一：鸡血细胞融合现象光镜观察（1040）融合中有两核的细胞图二：鸡血细胞融合现象光镜观察（1040）细胞刚开始融合六、讨论与结论 聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。由实验图片可得，照片中鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率并不高的。经分析主要是以下原因：由于P