免疫比浊法测定D-二聚体的临床实验评价.doc

免疫比浊法测定D-二聚体的临床实验评价第35卷第2期2005年4月温州医学院JournalofWenzhouMedicalCollege,bl_35NO.2Apr.2005免疫比浊法测定D一二聚体的临床实验评价郑美琴.李承.江明华(温州医学院第二附属医院检验科,浙江温州325027)与疆摘要目的:对免疫比浊法定量测定D一二聚体的方法进行临床实验评价.方法:实验评价包括精密度测定,线性测定,回收实验以及干扰实验.结果:该D一二聚体定量测定试剂线性测定良好(01050)ng/ml(大于该值需用因子稀释液稀释后再做测定),在(2001050)ng/ml之间精密度测定cV小于10;回收率在96%102%之间,平均98.1%;回归方程为Y=I.019X土17.08,r=0.9993;对胆红素,血红蛋白,甘油三酯均具有较好的抗干扰能力,类风湿因子对该试验干扰较大.结论:该方法简便,快速,敏感,适合临床使用.关键词D一二聚体;免疫比浊法;方法学评价;精密度;线性;干扰中图分类号R446.61文献标识码B文章编号10002138(2005)02015703血浆D一二聚体(D-Dimer,D-D)是经凝血因子xIIIa作用形成交联的纤维蛋白在纤溶酶作用下所产生的一种特异性降解产物,是反映凝血及纤溶系统活化的分子标志物之一.当血管内血栓形成时产生大量交联纤维蛋白,纤溶酶活性继发性增强,血浆DD含量增高.因此,检测血浆D.D含量对血栓性疾病的诊断及溶栓治疗监测等有重要意义,也是鉴别原发性和继发性纤溶的良好指标.目前,血浆DD检测方法主要有胶乳凝集法,酶联免疫吸附试验,胶体金免疫渗透试验及免疫比浊法等.王学锋等l2认为免疫比浊法最佳,酶联免疫吸附试验次之.本研究所用比浊法DD试剂盒在临床上应用的时问尚短,其特点及其应用的报道较少,因此,我们重点对免疫比浊法检测血浆D?D进行了实验评价.1材料和方法1.1标本收集抽取受检者静脉血1.8ml,加入装有109mmol/L枸橼酸钠0.2ml的塑料试管中,轻轻颠倒混匀,3000r/min,离心10min,分离血浆待测.注:若红细胞比积(HCT)明显异常,抗凝剂用量应校正,校正公式如下:抗凝剂的体积(m1)=1.851o血量(m1)(1O0-HCT)1.2仪器和试剂1.2.1仪器:BECKMANCOULTER公司的ACL6000血凝仪.1.2.2试剂:INSTRUMENTATIONLABORATORY公司的D.收稿日期:20040917作者简介:郑美琴(1971),女,浙江衢县人,主管检验师.Dimer试剂盒,包括:定标液批号B30041,胶乳试剂批号B30041,BUFFER批号B30041.I.3检测方法1.3.1原理:以抗DD单克隆抗体标记聚苯乙烯颗粒,在此颗粒抗体集合物中加入受检血浆,如血浆中含D.D,则发生凝集反应,通过检测浊度的增加,可计算血浆DD的含量.1.3.2仪器校正和建立标准曲线:用标准液和试剂作DD定标测定,仪器自动倍比稀释的方法建立标准曲线.在ACL6000上进行,当标本DD浓度大于300ng/ml时为阳性,否则视为阴性,浓度大于1050ng/ml时需稀释后作进一步检测,结果等于仪器测定值乘以稀释倍数.由于国内尚无此配套质控品,故每次试验时,将定标液及已配制好的混合血浆当作标本同时进行测定与质量控制.1.4实验方法1.4.1批内精密度测定:取已测高值标本,用低值混合血浆稀释成低,中,高三个浓度,重复测定2o次.然后分别计算平均值,标准差,变异系数.1.4.2批间精密度测定:上述标本分装并于一4o.C保存,用上述D一二聚体定量测定试剂分别进行测试,连续测定20d,分别计算平均值,标准差,变异系数.1.4.3回收率实验:取一个非溶血,黄疸,脂浊血浆标本进行测定1o次,计算均值,然后在血浆中添加已知不同浓度的标准物,最终浓度分别为278.41ng/ml,330.91ng/ml,383.45ng/ml,488,45ng/ml时,再进行测定,最后计算回收率.一l57第35卷温州医学院第2期1.4.5线性测定:取一个高值标准物用因子稀释液进行梯度稀释,然后对备浓度进行测定,将测定值与理论值进行线性回归分析.1.4.6干扰实验:用高,中,低三个浓度的血浆标本,按浓度梯度分别添加胆红素,血红蛋白,甘油三酯,RF(类风湿因子)测定备干扰物对结果的影响.每个标本测定三次求平均值作为加干扰物后的测定值,参照NCCLS表1D-D检测的精密度实验结果Tab.IResultsofprecisiontestofDDimerimmunoassay中干扰试验评价标准l,该测定值在已知标本浓度的1.96sd范围内,视为无显着性干扰.2结果2.1精密度检查由于D_D的参考值范围为<300ng/ml,故低值取此附近.实验结果见表1.该试剂在精密度方面完全符合临床使用的要求,试剂在高,中值范围内的CV%均在5%以内,低值也能达到lo%以内,重复性性能表现良好.此外增加了一部分低于200ng/ml的标本进行重复性测定,发现C,大于1o%.2.2回收率测定该试剂在各浓度段的回收率均大于95%,平均为98.1%.非特异性结合的影响较少,使用上可合乎临床上使用的要求.具体结果见表2.表2D-D检测的回收率试验结果Tab.2ResultsofreclamationtestofDDimerimmunoassayD-D最终浓度ng/ml回收率%278.41330.91383.45488.451O1.697.897.O96.O2.3线性测定D-D的正常参考值为(0255ng/m1).从实验结果可见,该试剂的线性测定范围为(o1050)ng/ml,线性良好(Y=1.019X17.o8,=0.9993),高于此值则用因子稀释液1:5,1:25,1:625等比例稀释后重新测定,完全能满足临床的测定要求.线性测定结果见图1.2.4干扰实验D?D定量测定试剂在胆红素浓度为o4.9mg/dl(83.79mol/L),血红蛋白浓度为o5omg/dL(500g/L),甘油三酯浓度为998.8mg/dl(11.30mmol/L),RF<60IU/ml的干扰情况下,各浓度范围的平均偏差均在1.96sd以内,视为无显着干扰.详细结果见表3.3讨论二妄三趔蘑理论值lng/m1)图1DD试剂线性试验结果Fig.1Resultoflinarityofd-dimerimmunoassayD-D是交联纤维蛋白降解的特异性分子标志物,检测血浆D?二聚体已成为判断血栓形成危险性直接而实用的方法.然而,D一二聚体检测方法不同,在临床应用中存在差异,十分有必要进行方法评价和广泛的临床应用.D-D测定方法主要有:胶乳凝集法,酶联免疫吸附试验(ELISA法),胶体金免疫渗透试验法及免疫比浊法.胶乳凝集法,是一种半定量的试剂盒,敏感度较低,只能作为筛查.ELISA法的敏感性较好,是检测D-D的经典方法,但是,它存在操作费时,复杂的不足,每次均需同时做标准曲线,增加了操作成本,不适于单个标本检验.然而对进行溶栓治疗的患者来说,作D-D浓度的动态观察是十分必要的,所以需要尽快,逐个出结果,随时调整治疗方案.可见ELIS法在临床应用中还存在缺陷.胶体金免疫渗透试验法虽然速度较快,但重复性和准确性都不是很好,而且与ELISA法的结果相关性并158第35卷郑美琴,等:免疫比浊法测定I卜二聚体的临床实验评价第2期表3D-D检测的干扰试验结果Tab.3Resu1tsofinterferenceofDDimetimmunoaSsay不好81.临床上急需一种快速,简便,准确的D-D定量测定方法,以便能及时准确地判断患者的病情.ILTestD-Dimer定量测定试剂采用免疫比浊法,其反应原理是以抗DD单克隆抗体标记固相载体聚苯乙烯颗粒,在此颗粒抗体集合物中加入受检血浆,如血浆中含D-D,则与上述颗粒发生凝集反应,导致光产生散射效应,从而引起反应系统中透光度的减低,在405nm处比色并记录其变化,从标准曲线上读出结果,由此定量测定出血浆中D-D的含量.该实验在ACL6000型以上血凝仪上均可进行,使用方便,操作简单,为定量测定试剂盒.本研究发现,该试剂在高,中值范围内的CV%均在5%以内,低值(278.41ng/m1)也能达到1o%以内,重复性性能表现良好;平均回收率达到98.1%;线性良好(Y=1.019x17.08,=0.9993);另据文献报道j,ILTestD-Dimer与ELISA法具有相似的敏感度及阴性预示值;而且整个测试时间只需10min,可用于临床急诊需要,特别对深层静脉血栓,微细血管血栓和肺梗死病症的提前诊断意义更大tS-Tj,另外也可作为临床溶栓治疗的动态观测指标.但是该方法也有其局限性:线性范围较窄(01050ng/m1),超出此范围必须用因子稀释液手工稀释重新测定.本试验增加一部分D-D浓度在200ng/ml以下的标本,测定结果显示cV值可达106以上,但由于95%可信度范围是0300ng/mlsl,故对临床使用影响不大.胶乳试剂的稳定期不够长,复溶后5d内较稳定,1w以后测定结果c,可以达到20%以上.RF对该试验的影响比较大.这是由于RF是一种变性的IgG,与天然的IgG结合能力较差,但易与免疫复合物中的IgG发生聚合反应,影响结果的准确性.因此对RF阳性的患者应该对标本进行预处理,即:在RF阳性标本中加入抗人IgG以中和RF,混匀后,置37.C水浴中30min,离心取上清液,再测DD含量,才能客观地反映患者的实际情况41.综合上述实验分析结果,IL-TestDDimer是完全定量,完全自动化,快速,方便的试验,特别是采用了比浊法原理,使测定的特异性得到增强,在ACL6000以上血凝仪上即可进行测定,完全能满足临床需要.参考文献:11吕永强,何冰.血浆中D二聚体测定的临床意义.武警医学院,200l,l0f2):l64,168.21千学锋,王鸿利,谢鑫友,等.血栓与止血的检测及应用M1.上海:世界罔书出版公rd,2002.102.郭雪梅,工鸿利.快速D一二聚体检测在诊断静脉血栓形成中的应用进展lJ1.中旧实验诊断学,2000,4f1):4卜4341李静,刘建半.类风湿因子对ELISA法D一二聚体测定结果的干扰分析lJ1.蚌埠医学院,2001,26(4):358-35951郑洪泽,张芳,张静,等.血浆D一二聚体检测及临床应用.滨州医学院,2000,23f4):398399.61RCGosselin,JTOwings,RCJacoby,eta1.EvaluationofanewautomatedquantitativeDDimer,AdvancedDDimer,inpatientssuspectedofvenousthromboembolismJ.BloodCoagulationandFibrinolysis,2002,l13(4):32333071MJKovas,KlVlMackinnon,DAnderson,eta1.AcomparisonofthreerapidDdimermethodsforthediagnosisofvenousthromboembolismJ.BritishJournalofhaematology,2001,115f11: