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南方医科大学南方医院 侯金林,乙型肝炎血清学诊断新进展,肝功（LFT） 血清标志物 HBV DNA YMDD,cccDNA,HBV mRNA,内质网,高尔基体,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依赖聚合酶,RNA依赖聚合酶,胞核,肝细胞,HBsAg,HBeAg,HBV DNA,血 清,耐药突变,cccDNA,HBV mRNA,内质网,高尔基体,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依赖聚合酶,RNA依赖聚合酶,胞核,肝细胞,HBsAg,HBeAg,HBV DNA,血 清,耐药突变,HBsAg 我们了解什么?,HBsAg 最老标志， 经典，简单? 易检测，难清除 未知不少: 清除机理？半衰期？,EM,回归血清学?,量,基因型/亚型 变异体 肝组织/血清浓度的比例,HBsAg定量检测：i2000的缺点,检测范围窄：0.05-250 IU/ml；,稀释步骤：手工，耗时 ；,大部分样品需要稀释后重新测定,大部分样品需要稀释后测定,HBsAg定量检测的应用,一、了解影响血清HBsAg水平的因素,二、了解抗病毒治疗下血清HBsAg的 动态变化特点,HBsAg与HBV DNA水平正相关,B基因型的HBsAg水平更高,独立影响血清HBsAg水平： HBV DNA 和基因型,基因型C: 肝内HBsAg水平更高,HBV/C: HBsAg转运障碍？,基因型HBsAg转运临床结局？,基因型C感染,肝内HBsAg滞留,肝细胞对细胞因子引起的损伤更敏感 1,HBsAg转运障碍？,肝细胞表面内源性肽高水平递呈 2,内质网压力（ER stress)增高 3,基因C型患者肝脏损伤更严重,1, Kalinina, et al. Hepatology, 2001 2, Gilles, et al. Hepatology, 1992 3, Xu, et al. J Virol, 1997,HBsAg动态变化,研究目的 HBV 复制持续抑制时HBsAg的动态变化,HBsAg的动态变化,入选标准 HBeAg阳性 拉米夫定长期治疗，之前无抗HBV治疗； 病毒抑制快速：治疗24周HBV DNA阴性 病毒抑制持久：HBV DNA阴性持续至156周,基线资料,HBsAg动态变化特征 与HBeAg转阴与否无关,基因型影响HBsAg的变化特点,个体患者HBsAg变化的主要类型,cccDNA,HBV mRNA,内质网,高尔基体,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依赖聚合酶,RNA依赖聚合酶,胞核,肝细胞,HBsAg,HBeAg,HBV DNA,血 清,耐药突变,HBeAg定量检测,亚培公司曾经提供过HBeAg定量检测服务，但目前没有商品化的HBeAg定量试剂,Fig 3,cccDNA,HBV mRNA,内质网,高尔基体,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依赖聚合酶,RNA依赖聚合酶,胞核,肝细胞,HBsAg,HBeAg,HBV DNA,血 清,耐药突变,HBV cccDNA,HBV共价闭环(covalently closed circular, ccc)DNA是前基因组(pg)RNA合成的模板。是病毒复制的模板, 其数量决定病毒复制水平, 宿主免疫控制肝细胞的cccDNA数量, 肝内病毒复制和清除强度的平衡表现为血清病毒水平。,HBV cccDNA的定量,均依据松弛环状DNA和cccDNA在结构上的差异而设计，一些报告还采取酶消化的附加步骤以减少松弛环状DNA相对于cccDNA的比例以增加特异性 过高估计cccDNA水平, 有些方法甚至可以检测到血清中极高拷贝数的HBV cccDNA,不准确,不标准,不实用,HBV cccDNA的定量检测方法在特异性的提高上仍有空间； 同时采用目前的HBV cccDNA定量方法可能会对HBV生活周期的认识以及抗病毒治疗的策略制定产生误导，值得警惕 肝脏活检的不普遍性，HBV cccDNA定量的临床应用目前仍不现实。,cccDNA,HBV mRNA,内质网,高尔基体,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依赖聚合酶,RNA依赖聚合酶,胞核,肝细胞,HBsAg,HBeAg,HBV DNA,血 清,HBV DNA 检测,斑点杂交 （Dot-blot hybridization）,非PCR定量（Non-PCR based quantitative HBV DNA assays,定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays,1980s 1990s 2000s,血清HBV DNA定量,方法目前多以聚合酶链式反应（PCR）作为检测手段； HBV DNA定量的表达多以拷贝/毫升（copies/ml）或国际单位/毫升（IU/ml）表达，二者之间粗略的换算方法为1 IU/ml = 5 copies/ml。 血清HBV DNA定量检测的发展方向为更高敏感性（sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。,Minor fluctuation或minor rebound,例如罗氏公司的Cobas Taqman（敏感性为60IU/ml，动态范围可至108IU/ml)，目前刚完成或正在进行的临床试验多采用此方法，并将HBV DNA下降速率作为疗效的评价指标。 亚培公司的RealTime方法的检测范围与前者类似，检测下限可达10 IU/ml。 更早地监测到接受抗病毒治疗患者血清HBV DNA的波动甚至是反弹（minor fluctuation或minor rebound），,不同试剂HBV DNA检测范围,102 103 104 105 106 107 108 109 1010,Ultrasensitive Digene II,Cobas Amplicor,Versant HBV DNA 3.0,HBV DNA (copies/ml),Digene II,bDNA,NAXCOR,Cobas TaqMan,国产试剂盲区,国产试剂盲区,(无天, 无地,无标,无法,),HBV 标准品,HBV DNA levels determined by different tests cannot be compared directly WHO standard genotype A Eurohep standard (IU/ml),High prevalence of genotype recombinations in China,N=1096; from 9 centers,Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH J General Virology 2005,C,B,B,C,B,C, C/D, D,C:77%,B: 59%,B: 23%,C:41%,D,C/D 29%,B, C 71%,C6, C7?,Different geographical distribution of subgroups of HBV genotype C in China (n=526),Wang ZH. J Viral Hepatitis 2007; Wang ZH J General Virology 2005,Chan H. J Infect Dis. 2005,Prevalence of subgenotype C in China,N=534; from 9 centers,C2: 99%,C1: 1%,C1: 55%,C2: 45%,0,10,20,30,40,50,60,70,80,Ba,C1,C2,PC,BCP,P0.001,49/134 35/134,5/106 83/106 Cs,14/45 24/45 Ce,37,5,31,26,78,53,Wang ZH. JCM 2007; Wang ZH J General Virology 2005,HBV Genotypes and subgenotypes in China,Pure B (Bj strain),Pure D,C/D Hybrid (C6),Pure C (C1, C2),B/C hybrid (Ba strain),EcoR I site,HBV Genome,0,3200,Genotypes,S,PreC/C,nt1742 2495,nt10 799,For Genotyping,ayw,adr,ayw,adw,adw,Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005,nt10 1499,ayw,C/D Hybrid (C7),HBV Genotypes and subgenotypes in China,Pure B (Bj strain),Pure D,C/D Hybrid (C6),Pure C (C1, C2),B/C hybrid (Ba strain),EcoR I site,HBV Genome,0,3200,Genotypes,S,PreC/C,nt1742 2495,nt10 799,For Genotyping,ayw,adr,ayw,adw,adw,Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005,nt10 1499,ayw,C/D Hybrid (C7),Ox head and body but horse face (牛头马面),CD B C D,Inner Mongolia,Mongolia,Xinjiang,5.1%,INDIA,Geographical location and HBV genotypes distribution in different regions of western China,Ethnical distribution of CD hybrid in Western