免疫抗体.ppt

免疫球蛋白( Immunoglobulin, Ig ),1890年，Behring 和北里在德国Koch实验室从豚鼠体内发现了第一种抗体：白喉抗毒素，从而挽救了成千上万的白喉患儿，死亡率从60%降到26%。 获1901年的第一届诺贝尔奖。,抗体的发现,一、概述: Ig分子是机体中最神奇的、在结构上变换无穷的一类分子。它只由3个基因编码，但却产生100亿以上不同序列的蛋白质分子，应对数以亿计的病原微生物和异己分子。,概念,概念,4,与Ig 有关的诺贝尔奖获得者, Ig基因重排发生在B细胞 Ig来源于B细胞 Ig具有基本的4肽链结构 由重链及轻链组成异源二聚体 Ig基因重排是Ig表达的前提 可变区具有无限的多样性 Ig是重要的免疫分子 作为BCR识别抗原与发挥抗体活性,经典Ig的概念,免疫球蛋白：具有抗体活性或结构的球蛋白。 抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都有抗体活性。 抗体:主要是B细胞在抗原刺激后，增殖分化为浆细胞所产生的能与相应抗原特异结合的糖蛋白，是体液免疫的效应分子。,根据亚细胞定位Ig分为膜型及分泌型，膜型的称之为B细胞抗原识别受体（B cell receiptor, BCR); 分泌型称之为抗体（antibody),B细胞分化为浆细胞，产生抗体,B细胞缺失导致外周血Ig减少，体液免疫功能低下，易感染。,抗体的理化性质 单体Ig的分子量为150kDa-170kDa； 糖基化修饰（糖蛋白）； 电泳泳动位置主要为球蛋白； 对热相对稳定，（IgE除外）； 具有高度不均一性。,二、 免疫球蛋白的基本结构,（一）基本结构 1、四肽链结构 经二硫键共价结合2条重链和2条轻链,Edelman发现抗体 的重链和轻链结构,抗体的结构,还原剂,分子筛还原剂,2、重链（heavy chain, H） 轻链（light chain, L）,重链：450550aa, 5075kDa；（Heavy chain）： 分为5类 （gamma） IgG （mu ） IgM （alpha） IgA （epsilon ） IgE （delta） IgD 亚类：IgG1-4、 IgA1-2,5类抗体的结构模式图,轻链：214aa, 25kDa； 根据其恒定区aa组成和排列顺序（抗原性）不同，分为2型（type）：，； 亚型： ： 14。 一个天然Ig上的两条轻链的型别是相同的； 每个Ig只选用1个型别的轻链（或)，二者功能相同。 人： ：为2：1； 小鼠： ：为20：1。,3、蛋白酶水解片段,-S-S-,S-S,S-S,N,N,C,L,H,VL,CL,VH,CH1,CH2,CH3,木瓜蛋白酶 （papain） 2 Fab，1 Fc,胃蛋白酶 （pepsin） F(ab)2, pFc,Porter发现Ig的 Fab和Fc段,抗体的特异性,轻链及重链可变区共同决定抗体的特异性,可变区（Variable region） VL(N-L1/2);VH (N-C1/4) 恒定区（constant region) CL(C-L1/2); CH, (C-C3/4),4、功能区和结构域：两条重链和两条轻链都可折叠为数个球形结构域或功能区，每个结构域一般具有相应的功能。,1)可变区（variabl region,VH，VL）,高变区（hypervariable region, HVR）或互补决定区( complementary determining region, CDR)： VH和VL中直接与抗原接触结合、氨基酸组成和序列高度可变的区域； 骨架区（framework region；FR）： 其余区域为骨架区,FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4,V区,2）恒定区（constant region, CH ，CL区）,（1）CH ，CL; （2）和的C区长度基本一致； （3）、 、 的C区包括CH1，2，3； 而 ， 则含有CH1，2，3，4。 （4）针对不同抗原的同一类Ig，其V区不同，但 C区相同； 而针对同一抗原表位的不同类Ig，其V区相 同，C区不同。,5、铰链区 （hinge region）,1）位于CH1-CH2之间，富含Pro； 2）具有柔韧性，可折叠分别形成T型和Y型 3）易被蛋白酶水解； 4）IgG1，2，4和IgA铰链区短； IgG3，IgD铰链区长； IgM，IgE无。,（二）Ig的其它成分,1、J链（join chain，J chain） 1)浆细胞合成； 2)富含半胱氨酸； 3)连接2聚体IgA、5聚体IgM。,IgA J chain,2、分泌片（secretory piece, SP） 1)粘膜上皮细胞合成、分泌； 2)只存在于粘膜分泌型IgA中； 3)作用：保护IgA免受蛋白酶降解； 介导分泌型IgA从粘膜 粘膜表面,IgA SC,三、Ig序列的保守性,尽管Ig在进化过程中其恒定区相对保守，但不同种属间及相同种属不同个体间的相同类型Ig存在序列差异，该结构可以在不同种属间构成免疫原性；同一个体不同Ig分子之间也构成免疫原性。,Ag1,Ab1（Ag2）,Ab2,1、同种型（Isotype） 同一种属所有个体均具有的Ig抗原，主要存在于重链和轻链的稳定区中,2、同种异型（allotype，allotope） 同一种属不同个体所具有的Ig抗原，主要存在于重链和轻链的稳定区中，由IgC区内一个或数个氨基酸残基的差异所致。如 IgG： GM1，GM2，GM3，GM4. IgA: AM1, AM2 链：KM1，KM2，KM3 同种异型为个体型标志，又称同种异型遗传标志。,Allotypic Determinants,（三）独特型（ idiotype, Id） 同一个体不同Ig的抗原，主要存在于Ig 的V区。是指每个免疫球蛋白分子可变区肽链所具有的抗原特异性标志（独特位，5-6个）。一定条件下独特型表位可刺激机体产生抗独特型抗体，这对免疫应答的调节有重要意义。 Jerne 的免疫网学说（Immune network theory）的中心是独特型免疫调节。,Idiotypic Determinants,Ig的不均一性,数十种,四、五类Ig的特性及功能,Ig 分为五类（Class）： IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 其中IgG, IgA存在亚类（Subclass）： IgG1，2，3，4； IgA1，2,（一）IgG：单体；含量最高；半衰期20-23，可通过胎盘，一般是高亲和力抗体，是免疫功能最强的Ig分子；在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。 主要参与抗感染免疫；可引起介导免疫病理损伤。,IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用； IgG1、IgG3可高效激活补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等； 某些自身抗体和引起二、三型超敏反应的抗体也属于IgG。,（二） IgM： 含CH4（C4）； 膜结合型：单体，BCR； 分泌型：五聚体，分子最大，作用最强（结合抗原；激活补体）； 最早出现的抗体（个体发育；免疫应答）。,免疫球蛋白的进化,血清型IgM,主要参与抗感染免疫，补体依赖的细胞毒效应（比IgG强500倍）；识别并杀伤肿瘤细胞；识别并清除凋亡及衰老的细胞。 中和低密度脂蛋白防止动脉粥样硬化的发生。 是机体的忠实卫士。,（三）IgA： 血清型：单体； 分泌型：双聚体；呼吸道、消化道、乳腺等产生，外分泌液中的主要成分，在粘膜抗感染免疫中起中和作用； 初乳中含sIgA。,sIgA的结构,分泌型IgA的形成,IgA在肠道的免疫保护效应,（四）IgD 单体，主要存在于B细胞表面（mIgD）， mIgD是成熟B细胞的标志。,（五）IgE 单体形式，含CH4（C4），体内含量最低。 参与抗寄生虫免疫，发挥ADCC效应； 参与速发型超敏反应（4）。,（一）识别并结合抗原-中和作用，主要功能（V区） （二）活化补体； （三）调理作用； （四）ADCC； （五）通过胎盘（IgG）和粘膜(分泌型IgA)。 （六）免疫病理,五、抗体的生物学活性,抗体与抗原特异性结合发挥免疫效应,抗体的中和作用（neutralization） 1、V区特异结合抗原；中和毒素，阻断病原入侵； 2、单体Ig：2价； 分泌型IgA：4价；IgM：理论价10；实际5。,补体依赖的细胞毒作用（Complement-dependent cytotoxity）,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cellular mediated cytotoxity， ADCC）效应,调理吞噬,参与免疫病理作用： I 、II、III型变态反应 参与免疫复合物形成 （Immune complex）,六、抗体的多样性,抗体多样性（diversity）是指不同抗体的V区结构多种多样，能针对任何不同的抗原特异结合。,Susumu Tonegawa 发现Ig的基因重排 Nobel Prize 1987,利根川进认为，“不敢冒险的人，或者只会考试得分的人，是不适合于搞科研的”，“科学家的最重要的才能是要有怀疑的能力，要有丰富的想象力”。,利根川进 (日，S.Tonegawa)：20世纪70年代他进一步阐明了免疫球蛋白的基因结构，证实了其基因的重排和突变是抗体多样性的根据，使免疫球蛋白多样性的遗传控制找到了依据。,抗体的基因结构及重排的发现,Ig Gene Location,Heavy,kappa,lambda,人胚系基因中Ig基因片段,V片段（Variable segment） D（Diversity segment） J片段（Jioning segment）,重链V区的VDJ 重排（Rearrangement） 轻链V区的VJ 重排,重链可变区的VDJ重组,轻链基因胚系及重排后结构,68,Ig基因可变区重排的两个必要条件,（1）重组信号序列（recombination signal sequences, RSS）: 由七聚体、九聚体以及两者间的间隔序列组成 在各基因片段两侧存在 （2）重组活化酶(recombinase) 由重组活化基因（RAG）编码 有RAG-1和RAG-2两种 RAG出现于B细胞发育早期,重排信号序列RSS（recombination signal sequence）,69,V region,J region,通过RSS形成茎襻状结构,抗体多样性产生的机制,组合引起的多样性：众多的片断的随机组合。 连接引的多样性起: VDJ连接处的不准确连接和核苷酸插入，即连接处核酸的丢失或加入。 体细胞突变: 发生在抗原刺激后的成熟的B细胞已经重排过的V基因，常见于CDR区，特别是CDR3。主要是点突变。B细胞的V区基因突变进一步增加V区的多样性。体细胞突变可导致抗体亲和力成熟。,72,重排造成的多样性,1.抗原诱导前（天然发生的）,73,2.连接造成的多样性：即V(D)J重组时接头处的变化，出现N区和P核苷酸的插入,V-region N1 P D-region N2 J-region tgtgcgaga tgggatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgggatg ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgggatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgg .gatgttatgattggat ttcatacagc .tgactactgg tgtgcgaga tgg .gatgttatgattggat tctatacagc .tgactattgg tgtgcgaga tggaatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgggatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgggatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtgcgaga tgggatg .ttatgattggattttata cagc .tgactactgg tgtacca caaacctga ac gtattactatggttcggggaccga. accccc gactactgg tgtacca caaacctga ac gtattactatggttcggggaccga. accccc gactactgg tgtgcgaaag. tg c ggtatagtgagagttacta. .tgactcttgg tgtgcgaaag. tg c ggtatagtgagagttacta. .tgactcttgg,74,体细胞高突变: 成熟B细胞经抗原刺激后发生的序列高频率随机突变，局限于V区，多发生于CDR区，其中RGYW（RA/G，YC/T，WA/T）基序是突变的一个规律；与Ig亲和力成熟相关。,主要是体细胞高突变(somatic hypermutation),3.抗原诱导的V区序列的改变,抗体分子多样性,IGH IGK IGL 基因片段的组合 V 50 40 30 D 23 J 6 5 7 VDJ 6900 300 210 IgH/Igk(Igl)链的组合 6900（300210）3.5 106 不准确连接 多样性至少增加3000倍 核苷酸插入 多样性增加100倍 可能的组合 1011- 1012 重排基因的高频突变 突变频率是其它基因的100万倍以上 （导致抗体的亲和力成熟）,76,Ig基因同型排斥（isotype exclusion）,77,Ig基因等位排斥（Allelic exclusion ）,（一）多克隆抗体； （二）单克隆抗体； （三）基因工程抗体。,七、抗体的制备,利用抗原免疫动物后从血清中获得的抗体，含有针对不同抗原表位（epitope）的多种类型抗