GB-T19564-2004落叶松种子鉴定实验方法随机扩增多态性DNA法.pdf

I C S 6 5 . 0 2 0 . 2 0B61荡黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 9 5 6 4 - - 2 0 0 4 落叶松种子鉴定实验方法 随机扩增多态性D N A法 E x p e r i m e n t a l i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d f o r s p e c i e s o f l a r c h s e e d -R A P D2 0 0 4 - 0 6 - 2 2 发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 串 督留 瞥 臀 瓣 瞥袅 臀臀暴 发 布免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 前 合 r勺本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位： 国家农业标准化监测与研究 中心（ 黑龙江） 、 黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人： 王庆贵、 徐晶、 姜雯、 李光宇、 石绍业、 王卫国。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 引言 目 前 ， 我国林木种子的鉴定多采用感官鉴定 、 理化水平鉴定等方法。这些方法所需 的检验周期较长， 不具备分子水平鉴定的诸多优点。 随着分子生物学的发展 ， 特别是 2 0 世纪 9 0年代以来， 分子生物学的相关技术已被广泛应用 ， 其检测对象为D N A大分子生物的遗传基础。以D N A为检测对象， 具有许多其他检测水平所不具备的优点 ： 首先， 可供探测 D N A标记的数量可能是无限的， 这是同工酶技术所无法 比拟的； 其二， D N A分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段而异 ， 植物体任何部位 、 任何时期提供 的 D N A均可用于分析， 其检测结果都是一样的； 第三 ， D N A分析不受环境影响， 其变异只源于等位基因 D N A序列 的变异 ，这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异 ， 从而排除了环境变异所造成的表型变异。 基于上述优点 ， D N A分析技术是农 、 林 、 牧 、 渔等品种鉴定的先进方法。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 落叶松种子鉴定实验方法 随机扩增多态性D N A法1 范圈 本标准规定了落叶松种子鉴定的具体实验方法 。 本标准适用于利用随机扩增多态性 D NA ( R A P D ） 法对落叶松种子鉴定 的实验过程 。2 术语 、 定义和缩略语2 . 1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2 . 1 . 1 聚合醉链式反应p o l y m e r i s e c h a i n r e a c t io n 一种可以从少量至一个拷贝的特定碱基顺序的 D N A片断在体外花费几个小时即可扩增出数百万个分子的酶催化反应， 即D N A合成反应。2 . 1 . 2 随机扩增多态性D N A r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c D N A 是以聚合酶链式反应为基础， 用随机排列的寡聚脱氧核昔酸单链作为引物扩增基因组中不同位点的D N A， 进而揭示多个位点等位基因间多态性的一种分子标记方法。2 . 1 . 3 核昔酸n u c le o t i d e 是构成核酸的基本单元， 由三部分组成： 五碳糖、 磷酸和环状的含氮碱基。2 . 1 4 引物 p r i m e r 一条互补结合在模板D N A链上的短的单链， 提供3 - O H末端作为D N A合成的起点， 延伸合成模板 D N A的互补链 。2 . 1 . 5 多态性 p o l y m o r p h i s m 一对引物在两个或两个 以上不 同材料基 因组 D N A之间扩增 ， 得 到数 目不同或长度不同的 D N A片断。2 . 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 R A P D 随机扩增多态性D N A ( R a n d o m A mp l i f i e d P o l y m o r p h i s m D N A) P C R 聚合酶链式反应（ P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) D N A 脱氧核糖核酸（ D e o x y r i b o n u c l e i c A c id ) O D 光密度（ O p t i c a l D e n s i t y ) R N A核糖核酸（ R i b o n u c l e i c A c id ) T B E 三经基氨基甲烷一 翻酸一 乙二胺四乙酸二钠（ T r i s B o r ic - a c i d E D T A)标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B T 1 9 5 6 4 -2 0 0 43 实验方法3 . 1 原理 D N A是生物体的遗传物质， 携带所有的遗传信息， 从D N A分子水平上进行鉴别是区 分物种、 品种甚至个体之间差异的最为有效的方法。 利用P C R技术可以将D N A片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍， 从而达到可以检测的目的。R A P D方法是在P C R技术基础上采用随机核昔酸序列作为引物， 扩增基因组D N A， 这些扩增的D N A片段多态性便反应了基因组相应区域D N A的多态性， 根据扩增片断长度和片断多少所表现的差异， 鉴定某一物种和品种。3 . 2 环境条件 a ) 温度： 1 5 0C -2 5 0C； b ) 相对湿度： 相对湿度（ R H ） 不大于5 0 Y o .3 . 3 仪器 a ) P C R扩增仪； b ) 紫外分光光度计； c ) 高速台式离心机： 转速不小于1 5 0 0 0 r / m i n ; d ) 多用电泳仪及水平式电泳槽； e ) 紫外透射仪； f ） 微量移液器： 规格为0 . 1 p L -2 . 5 p L , 2 p .L - 2 0 p .L , 2 0 IA L - 2 0 0 p .L , 1 0 0 K L -1 0 0 0 p .L ; g ） 电子天平： 分度值为0 . 0 0 0 1 g ; h ） 磁力加热搅拌器； i ) 凝胶成像系统； J ） 超纯水系统； k ） 灭菌锅 ； 1 ) 酸度计： 最大允许误差为士0 . 1 p H; m ） 微波炉 ； n ） 恒温水浴锅 ： 最大允许误差为士1 0C ; 0 ) 恒温干燥箱： 最大允许误差为士1 0C,3 . 4 试剂和耗材3 . 4 . 1 试剂 a ) T a g D NA聚合酶： 保存条件为一2 0 士2 C； b ) 1 0 X B u f f e r ： 保存条件为一2 0 士2 0C； c ） 四种脱氧核昔酸（( 4 X d N T P ) ： 保存条件为一2 0 士2 C; d ) M扩十 ： 保存条件为一2 0 士2 V； e ) R N A酶（ 无D N A酶） ： 保存条件为一2 0 士2 C； f ） 琼脂糖（ a g a r o s e ) ； g ） 三经甲基氨基甲烷（ T r i s ) ： 分子式为C 4 H N 0 3 ; h ） 乙二胺四乙酸二钠（ E D T A N a t 2 H 2 0 ) ： 分子式为C 1 o H 1 4 N z 0 $ N a z . 2 H2 0; i ) 澳酚蓝（ b r o m p h e n o l b l u e s o d i u m s a l t ) ： 分子式为C , o H , B r 4 0 5 S N a ; J ） 二甲苯青F F ( x y l e n e c y a n o l e F F ) ： 分子式为C 25 H 2 , N 2 0 6 S 2 N a ; k ) 8 - 经基喳琳( h y d r o x y q u i n o l i n e ) ： 分子式为C 9 H , N O; 1 ） 十二烷基磺酸钠（ S D S ) ： 分子式为C 1 2 H a s O a S N a ; m ) 滨化乙锭（ E B ) ： 分子式为q1 H2 o N 3 B r ;标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B J T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 n ） 异戊醇： 分子式为C S H O H; o ) 结晶酚( p h e n o l ) ： 分子式为C 6 H s O， 保存条件为一2 0 士2 C; P ) 三抓甲烷： 分子式为C H C l 3 ， 纯度为分析纯； q ) 硼酸（ b o r i c a c i d ) ： 分子式为H 3 B 0 3 ， 纯度为分析纯； r ） 蔗糖（ s u c r o s e ) ： 分子式为 C 1 2 H 2 2 0 1 1 ， 纯度为分析纯 ； s ) 无水乙醇： 分子式为 C Z H S OH， 纯度为分析纯 ； t ) 盐酸： 分子式为 H C l ， 纯度为分析纯； u ) 抓化钠： 分子式为N a C l ， 纯度为分析纯； v ) 水： 分子式为 H 2 O。本实验所用水均为去离子水。3 . 4 . 2 耗材 a ) 离心管： 规格为1 . 5 m L , O . 2 m l , 。使用前需进行高压灭菌（ 按第A . 1 章中规定的方法进行操 作） ； b ） 研钵 ： 规格为直径 7 c m-1 0 c m; c ) 移液器吸头： 规格为2 0 li L , 2 0 0 Ii L和1 0 0 0 K L 。使用前需进行高压灭菌； d ） 容量瓶： 规格为1 0 0 m L , 1 0 0 0 mL ; e ） 烧杯： 规格为1 0 0 ml . ; f ) 三角烧瓶 ： 规格为 2 5 0 m L ; g ) P E手套； h ) 锡箔纸； i ） 封口膜。3 . 5 实验程序3 . 5 . 1 D N A的提取3 . 5 . 1 . 1 取落叶松种子5 粒g 粒， 放在1 . 5 m L离心管中， 加人6 0 0 tL L匀浆缓冲液（ 按第 A . 2 章中规定的方法进行配制） 浸泡 2 h ， 倒人研钵中充分研磨 ， 将研磨产物倒人 1 . 5 m L离心管中， 取少量匀浆缓冲液冲洗研钵， 一并倒人离心管中， 离心（ 转速为4 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 将上清液移至新的1 . 5 m L离心管中， 弃沉淀。3 . 5 . 1 . 2 加人与上清液等体积的饱和酚（ 按第A . 3章中规定的方法进行配制） ， 缓慢颠倒离心管2 0 m i n ， 避免剧烈振荡。3 . 5 . 1 . 3 离心（ 转速为8 0 0 0 r / rn i n ) 1 0 min ， 将上清液移至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 4 加人与上清液等体积的酚一 三氛甲烷一 异戊醇（ 体积比为 2 4=2 3: 1 ) ， 离心（ 转速为8 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 将上清液移至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 5 加人与上清液等体积的三抓甲烷一 异戊醇（ 体积比为2 3 z 1 ) ， 缓慢颠倒1 0 m i n ， 离心（ 转速为8 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 取上清液至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 6 加人上清液二倍体积的冰冷乙醇， 水平旋转离心管5 0 圈1 0 0圈， 即可出现白色絮状D N A ,3 . 5 . 1 . 7 将离心管置于一2 0 冰箱中 3 0 m i n ， 取出后离心（ 转速为 8 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m in ， 形成白色沉淀。3 . 5 . 1 . 8 倒掉离心管中的液体， 加人 1 m L 7 5 乙醇， 离心（ 转速为1 5 0 0 0 r / m i n ) 5 m i n ， 倒掉乙醇， 倒置在干净的吸水纸上， 吸干液体。3 . 5 . 1 . 9 将离心管置于恒温干燥箱（( 4 0 0C -5 0 0C） 中2 0 m i n或置于通风处4 0 m i n ， 使乙醇挥发。3 . 5 . 1 . 1 0 加人1 0 0 p L T E 缓冲液（ 按第A . 4 章中 规定的方法进行配制） 和R N A酶2 I .A L （ 按第A . 5 章中规定的方法进行配制） ， 水浴（ 5 5 士2 0C) 1 2 h ， 使 D N A沉淀充分溶解 ， 4 冰箱中保存。3 . 5 . 2 D N A浓度的检测3 . 5 . 2 . 1 紫外吸收检侧 D N A分子中的嗦吟环和喻吮环能够吸收紫外光。D N A 的紫外吸收高峰在波长 2 6 0 n m处 ， 蛋 白质的吸收高峰在波长2 8 0 n m处。取3 . 5 . 1 中提取的D N A溶液5 j .L ， 加水9 9 5 K L ， 放人比色杯中， 用免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4紫外分光光度计检测， 记下 2 6 0 n m 和 2 8 0 n m下的 O D值 ， 计算出 D N A 的浓度以及 o l ) 8 。 和 O 玖、 的比值。D N A的O D z so / O D z s。 最好在1 . 8 左右， 1 . 5以上也可用于R A P D - P C R分析， 若比值太小应重复3 . 5 . 1 . 2 - 3 . 5 . 1 . 1 0 步骤继续抽提 。 D N A浓度按公式（ 1 ) 计算： D 二 5 0 X 1 0 0 0 X O D z 6 o X s ， ， 二 。 一 ， 一 （ 1） 式中： D -D N A的浓度， 单位为纳克每微升（ n g 扭L ) ; s 稀释倍数。3 . 5 . 2 . 2 凝胶电泳检测 将制备好的浓度为。 . 7 的琼脂糖凝胶（ 按第A . 6 章中规定的方法进行配制） 放人电泳槽中， 使点样孔处于电源负极端， 加人恰好没过胶面 1 m m深的足童电泳缓冲液（ 0 . 5 X T B E ) （ 按A . 6 . 3中规定的方法进行配制） 。取D N A溶液1 0 j .L和凝胶加样缓冲液（ 按第A . 7 章中规定的方法进行配制） 2 t t L ， 在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀， 加人到点样孔中（ 避免出现气泡） 。打开电源， 将电压控制在5 V / c m， 电泳1h ， 取出凝胶， 放在紫外透射仪上观察。若 D N A质量好、 分子量高（ 5 0 k b ) 且无降解，则应在点样孔附近呈现一致密亮带， 若D N A部分降解， 则呈连续分布状态， 若严重降解， 则看不到大片段 D N A， 只能在远离加样孔的地方看到 R N A,3 . 5 . 3 R A P D扩增3 . 5 . 3 . 1 反应成分 2 5 A L 反应体系中， 含有1 X B u f f e r , l . 5 m m o l / L M g , 2 0 0 K m o l / L d N T P , l U T a g D N A聚合酶，1 t m o l / L 引物， 1 0 0 n g 模板D N A， 加水至2 5 fA L （ 各反应成分的配制按第A . 8 章中规定的方法进行） 。按上述比例将反应液依次加入 0 . 2 m L离心管中， 放人 P C R仪中， 进行 P C R循环。3 . 5 . 3 . 2 循环过程 循环过程如图 1 所示 ： 9 4 9 0 预变性 5 m i n 9 4 变性 1 m i n一 36 退 个 1 m in 40 个 循 环 7 2 延伸 1 m i n 7 2 C 延伸 1 0 m i n 4 冷却 圈 1 .P C R反应循环过程示盘圈3 . 5 . 3 . 3 电泳检测 将制备好的浓度为2 %琼脂糖凝胶（ 按第A . 6 章中规定的方法进行配制） 放人电泳槽中， 使点样孔处于电源负极端。取P C R扩增产物1 0 f .L和凝胶加样缓冲液（ 按第A . 7 章中规定的方法进行配制）2 p L ， 在封口 膜上用微量移液器上下吸打混匀， 加人到点样孔中（ 避免出现气泡） 。打开电源， 将电压控制在3 V / c m， 电泳3h ， 取出凝胶， 在凝胶成像上扫描。3 . 5 . 3 . 4 鉴定 将待测种子的凝胶成像结果与该品种的各分布区种子的标准谱带相比较， 从而鉴定出该品种的真实性 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 附录A （ 规范性附录） 灭菌方法及缓冲液和主要试剂的配制A . 飞 商压灭菌的操作方法 将欲灭菌的离心管放人烧杯中， 用锡箔纸封口； 移液器吸头装在吸头盒内； 配好的试剂装人试剂瓶中， 盖好盖， 放人灭菌锅中。首先将压力升至1 P a ， 放气， 再将压力重新升至1 P a ， 开始计时， 2 0 m i n 后，将电源关闭 。待压力为零时 ， 取出离心管、 吸头及试剂瓶 ， 待用 。A . 2 匀浆缓冲液的配制 取1 m o l / L T r i s C l ( p H 8 . 0 ) 2 0 0 m L , 0 . 5 m o l / L E D T A( p H8 . 0 ) 5 0 mL和0 . 5 g S D S ， 加水至1 0 0 m L 。 使用前应保证S D S充分溶解， 若出现结晶， 应放在 5 0 水浴中溶解1 0 m i n eA . 2 . 1 1 mo l / L T r is C l ( P H8 . 0 ) ： 称取1 2 . 1 1 g T r i s , 溶于8 0 mL水中， 用浓 H C l 调节溶液的p H值至 8 . 0 ， 加水定容至 1 0 0 m L ， 高压灭菌。A . 2 . 2 0 . 5 m o l / L E D T A ( p H 8 . 0 ) ： 称取1 8 . 6 1 g E D T A N a 2 . 2 H 2 0 ， 溶于8 0 m L 水中， 在磁力加热搅拌器上剧烈搅拌， 用N a O H（ 约需2g 左右） 调节溶液的p H值至8 . 0 ， 加水定容至1 0 0 m L ， 高压灭菌。A . 3 饱和酚的制备 饱和酚的制备宜在通风橱或通风 良好的条件下进行。A . 3 . 1 将室温下的酚置于6 0 水浴中融化， 然后倒人蒸馏器中加热， 在1 8 0 左右搜集液体。经重蒸的酚分装贮存于一2 0 冰箱中备用。A . 3 . 2 将重蒸酚 6 0 水浴中融化后， 加人 8 - 经基哇琳达到终浓度 0 . 1 %， 加入等体积0 . 5 m o l / LT r i s C l ( P H 8 . 0 ) 溶液， 用磁力加热搅拌器混匀后静止一段时间， 移出上层水相， 重复此过程， 直到酚相的p H值大于7 . 8时， 即为饱和酚溶液， 装人棕色瓶中， 4 冰箱中贮存。A . 4 T E级冲液的配制 取1 mo l / L T r i s C l ( p H 7 . 6 ) 1 m L , O . 5 m o l / L E D T A( p H 8 . 0 ) 0 . 2 m L ， 加水至1 0 0 m L ,A . 4 . 1 1 mo l/ L T r is C l ( P H7 . 6 ) ： 称取1 2 . 1 1 g T r i s , 溶于8 0 mL水中， 用浓 H C l 调节溶液的p H值至 7 . 6 ， 加水定容至 1 0 0 mL ， 高压灭菌。A . 4 . 2 0 . 5 mo l / L E D T A( p H 8 . 0 ) ： 同 A . 2 . 2 .A . 5 R N A酶( 1 0 m g / m L ） 的配制 称取R N A酶 1 m g , 溶于1 0 0 t L T E缓冲液中， 水浴（ 7 0 0C ) 1 0 m i n ， 缓慢冷却至室温。A . 6 琼脂精凝胶的配制 配制浓度为0 . 7 （ 或2 %） 的琼脂糖凝胶需称取琼脂糖0 . 7 g （ 或2g ） 置于2 0 0 m L三角瓶中， 溶于1 0 0 m L 0 . 5 X T B E中， 在微波炉中溶化至溶液透明， 冷却至5 0 0 C - 6 0 0C， 加人澳化乙锭( 1 0 m g / m L ) ， 调至终浓度为 0 . 5 p .g / m L , 混匀后将凝胶倒人已封口并放好梳子（ 距底板 1 . 0 m m左右） 的载胶板上， 凝胶厚度在3 m m-5 mm为宜， 待凝胶完全凝固后放入电泳槽中备用。A . 6 . 1 澳化乙锭（ E B ) 贮液（ 1 0 mg / mL ) ： 称取1 g澳化乙锭， 溶于 1 0 0 m L水中， 用磁力加热搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解 ， 移至棕色瓶 中， 4 冰箱中保存 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4A . 6 . 2 5 X T B E ： 称取5 4 g T r is , 溶于8 0 0 mL水中， 加入2 0 mL 0 . 5 m o l / L E D T A( p H8 . 0 ） 和2 7 . 5 g翻酸， 定容至1 0 0 0 m L ， 高压灭菌， 贮存于室温。A . 6 . 3 0 . 5 X T B E ： 称取5 X T B E 1 0 0 m L ， 加水定容至1 0 0 0 mL ， 备用。A . 7 凝胶加样级冲液 0 . 2 5 %澳酚蓝、 0 . 2 5 二甲苯青F F , 4 0 环（ 质量浓度） 蔗糖水溶液。A . 8 反应体系中各反应成分的配制A . 8 . 1 1 U T a g D N A合醉 2 5 ji L反应体系中需加人T a g D N A聚合醉体积按公式（ A . 1 ) 计算： 1 V 妾 ” ” ” 一 “ “ “ 。 “ （ A . 1） D 式中： V T a g D N A聚合酶的体积， 单位为微升（ ft L ) ； D T a g D N A聚合醉的浓度， 单位为单位每微升（ U小L ) ,A . 8 . 2 1 。 5 m m o l / L M犷 2 5 p .L反应体系中需加人Mg t 十 体积按公式（ A . 2 ) 计算： 1 . 5 X 2 5 ， A 。、 V 二乏 荟 “ 巴” ” ” ” ” 一 ” “ （A , 2） D 式中： V Mg z 的体积， 单位为微升（ p L ) x D -M扩 十 的浓度， 单位为毫摩尔每升（ m m o l / L ) ,A . 8 . 3 1 0 w m o l / L引物 首先将引物离心， 然后加水稀释。加水体积按公式（ A . 3 ) 计算， 放在一2 0 冰箱中保存， 每次使用前用水稀释三倍， 终浓度即为1 0 p m o l / L , O D， 。 。 X 3 3 V 二 二 二 岑 梦 早 止 乡 井 竺” ” “ “ “ “ （ A , 3） M 火1 0 其中公式（ A . 3 ) 中M的计算按公式（ A . 4 ) 进行： M n A X 3 1 3 . 2 2 n G X 3 2 9 . 2 2 n C X 2 8 9 . 1 9 n T X 3 0 4 . 1 9 一6 1 . 9 7 ” ” ” ” （ A . 4） 式中： V 加水体积， 单位为微升（ p L ) ； M 一 引物分子量， 单位为克每毫升（ g / mL ) ; ， 碱基数 ； A 腺嚓吟( a d e n i n e ) ； G 鸟嚓吟( g u a n i n e ) ； C 胞啥陡( c y t o s i n e ) ； T 胸腺啼咤( t h y m i n e ) 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 4 -2 0 0 4 参考文献 1 J 。 萨姆布鲁克， E . F 弗里奇， T . 曼尼阿蒂斯 分子克隆 北京： 科学出版社， 1 9 9 6 2 B e n j a mi n L e v w i n . G e n e s a . N e w Y o r k ： O x f o r d U n i v e r s it y P r e s s , 2 0 0 0 3 J a i n . A . ， C . A p p a r a n d a , P . L . B h a l l a . E v a l u a t i o n o f g e n e t i c d i v e r s i t y a n d g e n o m e f i n g e r -p r i n t i n g o f P a n d o r e a ( B i g n o n i a c e a e ) b y R A P D a n d i n t e r - S S R P C R . G e n o m e 4 2 ， 1 9 9 9 . 7 1 4 -7 1 9 4 K o j i m a . T . ， T . N a g a o k a , K . N o d a , e t a l. G e n e t i c l i n k a g e m a p o f I S S R a n d R A P D ma r k e r si n E i n k o r n w h e a t in r e l a t io n t o t h a t o f R F L P m a r k e r s . T h e o r . A p p l . G e n e t . 9 6 ， 1 9 9 8 . 3 7 -4 5 5 L a n h a m . P . G . ， R . M. B r e n n a n . G e n e t i c c h a r a c t e r