细胞免疫学技术.ppt

2019/9/29,1,细胞免疫学技术种类,细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行分离、鉴定、计数，并测定其功能。,细胞分离技术 免疫细胞表面标志和功能的检测 T细胞表面标志和功能的检测 B细胞表面标志和功能的检测 NK细胞活性的检测 吞噬细胞检测技术,2019/9/29,2,第一节 免疫细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 二、细胞分离技术 三、分离标本的保存技术,2019/9/29,3,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。 2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。 3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。 马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。,马、牛、,羊等大动物一般从颈静脉采血，,猪从颈静脉、,前腔静脉或耳静脉采血，,家禽由翼下静脉或心脏采血，,兔由心脏或耳,静脉采血，,犬由颈静脉或四肢静脉采血，,豚鼠由心脏采血，,小白鼠则可断尾或剪断,腋下血管或剪断眼球采血。,2019/9/29,4,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （二）胸腺细胞悬液的制备 【方法】 4周龄健康小鼠，体重1416g。 （1）小鼠颈椎脱臼处死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。 （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。 （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数90%。,看视频,2019/9/29,5,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （三）巨噬细胞的采取 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法） 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备 【方法】20-25g小白鼠 （1）小鼠颈椎脱臼处死 （2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液 （3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度,2019/9/29,6,第一节 细胞的分离技术,二、细胞分离技术 （一）外周血白细胞的分离 根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。 1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。 抗凝血于室温或37静置3060分钟，血液即分成明显的3层： 上层为淡黄色血浆， 紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞 底层为红细胞 本法所得的白细胞损伤极轻微。,2019/9/29,7,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （一）外周血白细胞的分离 2、加速红细胞沉降法 利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。 上层富含白细胞 红细胞凝聚成串钱状沉积在底层， 本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。,2019/9/29,8,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （二）外周血单个核细胞的分离 （PBMC） 基本原理 根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.0751.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。,2019/9/29,9,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （三）淋巴细胞及其亚群的分离 1、淋巴细胞的分离 玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37 30 min40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hanks液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。 L-亮氨酸甲基酯法 单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。用本法获得的淋巴细胞纯度大于99，活力95。,2019/9/29,10,第一节 细胞的分离技术,一、标本的采取与保存 （三）淋巴细胞及其亚群的分离 2、淋巴细胞亚群的分离 根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞的技术。 E花环试验 分离T细胞群 尼龙毛分离方法 分离T、B细胞 亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群 荧光激活细胞分离仪（FACS） 最佳分离方法 磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术 ）,2019/9/29,11,免疫磁性微球的分离原理,直接法对细胞进行分类,间接法对T细胞进行分离,2019/9/29,12,第一节 细胞的分离技术,三、分离标本的保存技术 液氮深低温（196）保存技术 但降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。 1、冷冻保存 将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装小管。采用两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好的临界低温作为过渡站，如一80低温冰箱过夜，或放在液氮罐液面以上一层空间1520h，然后再移放或沉入液氮中。 2、复苏 复苏解冻必须迅速，力争在20s内使细胞完全融化。从液氮中取出后迅速移至40温水中，融化后要充分洗涤重悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。,2019/9/29,13,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （一）T淋巴细胞受体的检测 1、E受体的检测 （现多用于分离T细胞） 2、白细胞介素-2受体的检测 T细胞激活的特征 （多采用免疫组化学法）,2019/9/29,14,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （二）表面抗原的检测 用单抗检测T细胞表面抗原 方法：标记抗体着染法 抗体致敏花环法 1、间接免疫荧光法 淋巴细胞+抗相应CD的单抗洗涤 再加荧光二抗 洗涤取样制片荧光显微镜观察 计数l00200个淋巴细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性的T细胞百分率。,2019/9/29,15,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （二）表面抗原的检测 2、抗体致敏细胞花环法 淋巴细胞悬液 + 抗CD抗体致敏的RBC悬液置室温片刻，经低速离心移放室温1小时 / 4过夜后 重悬取样涂片染色镜检 共计100200个淋巴细胞，以花环形成细胞数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。,2019/9/29,16,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （三）T细胞功能的检测 1、T细胞增殖试验（ T细胞转化试验） 判断T细胞功能的一项非特异性体外免疫学检测指标。 基本原理 在体外T细胞与刺激物共育后，细胞代谢和形态相继会发生一系列的变化，在2448h内，蛋白质和核酸合成增加，最终T细胞呈母细胞化，出现分裂增殖现象。 有形态计数法和放射性核素计数法两种,2019/9/29,17,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （三）T细胞功能的检测 2、T细胞介导的细胞毒 （LMC）试验 评价机体细胞免疫水平的一种常用指标， 肿瘤患者的判断预后和观察疗效的指标之一。 （1）形态学检查法 淋巴细胞+肿瘤细胞混合共温培养后 瑞氏染色 光镜计数残留的肿瘤细胞数，计算杀伤率。 本法不需特殊设备，操作较方便，但敏感性较差，不能确切反映细胞的损伤和死亡,2019/9/29,18,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,一、T细胞标志及功能的检测 （三）T细胞功能的检测 2、T细胞介导的细胞毒 （LMC）试验 （2）放射性核素法 一般采用125I-UdR掺入法或51Cr释放法。,2019/9/29,19,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,二、B细胞标志及功能的检测 （一）受体的检测 SmIg标志的检测 多采用间接荧光免疫法或酶免疫组织化学法 （二）表面抗原的检测 用相应的CD系列单抗，用荧光免疫、酶免疫组织化学技术加以检测 CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原,2019/9/29,20,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,二、B细胞标志及功能的检测 （三）B细胞功能的检测 1、血清中免疫球蛋白含量测定 检测方法：琼脂单向扩散试验，方法较粗糙； 现用ICS仪作自动速率散射比浊法， 迅速可靠。,2019/9/29,21,2019/9/29,22,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,二、B细胞标志及功能的检测 （三）B细胞功能的检测 2、细胞产生抗体能力的体外试验 检测B细胞体外产生抗体的能力，不仅可以了解B细胞功能，还可研究B细胞分化增殖所需的条件，以及T细胞和巨噬细胞等与B细胞相互作用的调节机制。,2019/9/29,23,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,二、B细胞标志及功能的检测 （三）B细胞功能的检测 2、细胞产生抗体能力的体外试验 （1）溶血空斑技术又称空斑形成细胞试验 基本原理 用SRBC免疫动物不同天数后，取脾脏制成细胞悬液。将其与SRBC在半固体琼脂凝胶内混合，倾注于平皿或玻片上使成薄层，置37温育。抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，后者与周围SRBC结合使补体活化而产生溶血，在细胞周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。每个空斑表示一个抗体生成细胞。,2019/9/29,24,2019/9/29,25,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,三、NK细胞活性的检测 （一） NK细胞活性检测的方法 1、形态学检测法 基本原理 将效-靶细胞按一定比例混合共温后，用台盼蓝、伊红丫等（活细胞拒染）染料染色，分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，由此推算NK细胞的杀伤活性。 用台盼蓝染色，须在3min内完成计数，否则活细胞也将开始摄取染料而着染。伊红丫染色在110min内，死、活细胞比例不变。 本法简便易于掌握，但主观因素较大，也无法计出遭轻微损伤的细胞。,2019/9/29,26,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,三、NK细胞活性的检测 （一） NK细胞活性检测的方法 2、酶释放检测法 基本原理 将效-靶细胞共育一段时间后，根据靶细胞破坏后释放的酶量推断死亡的细胞数。通常以乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶为检测指标。取共育后离心的上清液，加酶底物显色。根据光密度的变化确定酶含量的多少。 特点 经济、快速、简便，可定量。 影响因素 有培养液、pH、温度以及终止反应的时间等。实际操作时要严格掌握条件,2019/9/29,27,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,三、NK细胞活性的检测 （二）NK细胞活性检测的临床意义 临床的辅助诊断以及判断预后，考核疗效,2019/9/29,28,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,四、吞噬细胞检测技术 （一）中性粒细胞的检测 中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。 1、中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测 受检细胞悬液内按一定比例加入活的白色念珠菌悬液，混合保温后，加亚甲蓝(美蓝)溶液作活体染色，取样涂片作光镜检查。如胞内白色念珠菌呈蓝色，表示该菌已被杀死，共计100200个细胞，分别求其吞噬率和杀菌率。,2019/9/29,29,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,四、吞噬细胞检测技术 （一）中性粒细胞的检测 中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。 1、中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测 正常情况下，对大肠杆菌的杀菌率90，对金黄色葡萄球菌的杀菌率85,2019/9/29,30,第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测,四、吞噬细胞检测技术 （二）巨噬细胞功能的检测 巨噬细胞功能