1.组织病理学制片技术.ppt

组织病理学制片技术,德江县人民医院病理科,1,病理技术的应用,帮助临床查明死因(尸检); 手术后病变标本，明确诊断(临床活检); 为教学、科研提供资料;,取材(Sample collection)固定(Fixation)脱水(Dehydration)透明(Transparentizing) 浸蜡(Paraffin soaking)包埋(Embedding),第一节 组织处理,1. 人为因素 2. 标本大小 3. 取材时间 4. 包埋方向 5. 边缘标记,一、取材(Samples collection),6. 小标本的处理方法 7. 特殊情况取材 8. 取材数量 9. 清除多余成分 10. 重复取材 11. 核对取材 12. 剩余组织存放,二、固定(Fixation),固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。 (一)固定的目的 1. 迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。 2. 使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变成不溶性物质，并保持原有的空间位置。 3. 固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。 4. 组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和力，利于染色和观察。,（二）常用的固定方法,1. 浸泡固定法 2. 灌注固定法 3. 细胞涂片的固定方法 4. 微波固定法 5. 蒸气固定法,（三）常用的固定液,1. 单纯固定液 (1) 甲醛(formaldehyde) (2) 酒精(alcohol) (3) 苦味酸(picric acid) (4) 丙酮(acetone) (5) 醋酸(acetic acid),2. 混合固定液 (1) Bouin液 ：用于结缔组织及脂肪染色； (2) Zenker液：常用于三色染色； (3) 4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；,（四）固定时的注意事项 1. 标本 应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。 2. 固定液的用量 一般固定液用量为组织块体积的1020倍，贵重的固定液不少于35倍。,3. 防止组织变形 柔软或较薄的组织先平铺在吸水纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。 4. 固定液的穿透性 一般固定液在24h内不能穿透厚度大于23mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织，故取材组织块的厚度原则上不应超过34mm。 5. 固定时间 固定的时间与固定液的种类、组织类型、块大小、温度等有关。一般1.5cm1.5cm0.2 0.3cm大小的组织块, 固定时间为1224h。 6. 固定温度 大多数可在室温(25)固定，在低温(如4)固定时，固定时间要相应延长。,三、脱水(Dehydration) 组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。 常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。 为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。,四、透明(Transparentizing),常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。 目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快速石蜡切片效果较好。,五、浸蜡(Paraffin wax soaking),用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中二甲苯的过程。,六、组织的包埋和包埋方法 (Embedding) （一）常规石蜡包埋 （二）脱落细胞标本的包埋 （三）微小标本的包埋,第二节 组织切片法 (Tissue sectioning),组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。,一、组织切片机和切片刀 1. 石蜡切片机 2. 火棉胶切片机 3. 恒冷箱切片机 4. 震动切片机,石蜡切片机,震动切片机,恒冷箱切片机,切片刀 切片刀是切片机的重要部件，常见的有两种： 一种为可重复使用的钢刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、2024cm等，根据切片刀的形态，有平凹型、深平凹型、平楔型、双凹型。 另一种为一次性钢刀片，是一种薄型切片刀片，用于普通石蜡切片。使用时固定在特制的刀架上。,石蜡切片机用一次性钢刀片,二、组织切片(Tissue sectioning),石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。,(一)切片前的准备 1. 备齐常用器具, 如玻片、毛笔和铅笔或刻字笔。 2. 检查切片机的工作状态, 将固件都拧紧，检查切片刀是否锋利, 切片刀质量是保证切片的关键。如果使用一次性刀片, 应根据切片情况及时调整刀刃位置。,（二）切片制作过程 1. 蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡块切面与刀刃接近。 2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端，用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水温一般低于蜡熔点1012)，待切片展平后，即可进行捞片。,3. 切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织的浆膜面等)。 4. 捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。要留出贴标签的空间， 5. 捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。捞好的切片应在60左右烤箱内烤至少30min。以防染色时脱片。,（三）石蜡切片制作时的注意事项 1. 组织的取材和固定 ； 2. 组织脱水、透明和浸蜡 ； 3. 切片组织块固定不牢时； 4. 切片刀和切片机 ； 5. 特殊要求切片的制作 。,第三节 冰冻切片法,冰冻切片可用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。已固定的组织块经流水冲洗后再进行切片。,冰冻切片法 恒冷箱切片机 提前开机预冷，一般工作温度设定在-22左右。待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。顺序如下：将组织用OCT粘在样品托后放置在速冻台上；组织冻结后，将样品托固定到样品台上；调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后，放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。切出的切片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。,取材 负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。选取最具代表性的组织制片，必要时应多点取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡切片进行对照，有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的水平。,第四节 脱落细胞制片技术,脱落细胞标本包括：胸水、腹水、尿液、脑脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的细胞，在临床上具有非常重要的诊断价值。,一、细胞标本的取材 细胞标本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备等。 (一)印片法 常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将载片轻压于切面上，吹干后立即浸入固定液内5l0min，取出自然干燥，低温储存。优点是操作简单，细胞抗原保存好。,(二)穿刺液沉淀法 常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿剌液少，可直接涂片，细胞尽量涂均匀。穿刺液多，细胞丰富，可置离心管内，以500rpm低速离心5l0mi