秋C免疫学检测技术的基本原理.ppt

1,第二十二章 免疫学检测技术,2,免疫学检测技术的基本原理,体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 体内：抗原+抗体免疫反应 体外：抗原+抗体进行检测 检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验） 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 免疫细胞功能的检测,3,第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素,（一）抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） 4.抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段,4,1.高度特异性,抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体CDR的互补结合(相互吻合，具有互补性)。,5,抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。,2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）,6,特异性,结合力的表示方法,亲和力和亲合力,低亲合力,高亲合力,Ag-Ab结合的力,亲和力,亲合力,低亲和力,高亲和力,7,3.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）,8,（二）抗原抗体反应的影响因素,1.电解质 0.85%氯化钠或各种缓冲液 2 .温度 37 56 3 .酸碱度 最适pH值在6-8之间,9,第二节 检测抗原或抗体的体外试验,10,定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块现象。,一、凝集反应（agglutination reactions),11,包括： 1.直接凝集反应 (direct agglunitation reatctions) 玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：抗体效价的判定 2.间接凝集反应 (indirect agglunitation reactions),12,直接凝集反应,1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16,玻片法,试管法,ABO血型鉴定或菌种鉴定,检测抗体的滴度或效价,13,将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。,间接凝集反应,14,二、沉淀反应（precipitation reactions）,定义： 可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。,15,可在液体/半固体琼脂中进行。 包括： 1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量） 2.双向琼脂扩散 3.免疫电泳,16,单向琼脂扩散,用于确定抗原浓度,17,双向免疫扩散,鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原纯度鉴定,18,免疫电泳,存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。 沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。,19,将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类试验方法。,三、免疫标记技术(immunolabeling techniques),20,常用的标记物： 酶 荧光素 放射性元素 胶体金 化学发光物质等,21,免疫酶测定法,双抗体夹心法ELISA 间接ELISA,BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁,22,d）免疫组化技术,定位、定性、定量检测,23,免疫荧光技术,24,25,放射免疫测定,用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。,化学发光免疫技术,将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。,26,免疫胶体金技术,用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。,27,免疫印迹法-Western blotting,28,四、蛋白质芯片技术,又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。,29,第三节 免疫细胞功能的检测,淋巴细胞及其亚群的分离,免疫细胞 功能测定,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽-MHC四聚体技术,T细胞功能测定,B细胞功能测定,细胞因子检测,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51Cr释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,30,一、免疫细胞的分离,外周血单个核细胞的分离,31,E花环形成试验,32,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽MHC四聚体技术,淋巴细胞及其亚群的分离,33,免疫吸附分离法,加入淋巴 细胞悬液,34,磁珠分离法,35,流式细胞术,36,二、免疫细胞功能的测定,T细胞功能测定,B细胞功能测定,细胞因子检测,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51Cr释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,37,T细胞功能测定,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法：,外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。,38,B细胞功能测定,抗体含量测定,溶血空斑试验,可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。,绵羊红细胞(SRBC)免疫动物,4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞,脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中