分子生物学第九讲核生物基因表达调控.ppt

第九讲. 基因的表达与调控 -真核基因表达调控模式,2, 真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。,3, 真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类： 第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。 第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。,4,研究基因调控主要应回答3个问题： 什么是诱发基因转录的信号？ 基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？ 不同水平基因调控的分子机制是什么？,5, DNA水平调控（DNA regulation）; 转录水平调控（transcriptional regulation）； 转录后水平调控（post transcriptional regulation）； 翻译水平调控（translational regulation）； 蛋白质加工水平的调控（regulation of protein maturation）等。,根据基因调控在同一事件中发生的先后次序又可分为：,6,多级调控,DNA水平,基因丢失 基因扩增 基因重排 甲基化修饰 染色质的结构状态,RNA水平,转录水平调控 RNA的转录后加工 mRNA向胞浆转运 mRNA稳定性,蛋白质 水 平,翻译过程 翻译后加工 蛋白质的稳定性,一、真核生物调控的特点,7,8,基因表达以正调控为主 转录与翻译在不同的区域进行 无操纵子和衰减子 个体发育复杂 受环境影响较小,9,真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构存在几个方面的差异, 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。(真核生物是单顺反子） 真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。（有染色体结构） 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。（是断裂基因） 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。,10, 在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。 在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。,11, 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。,12,1、DNA水平调控,1）“开放”型活性染色质（active chromatin）结构对转录的影响 A 常染色质(euchromatin):压缩程度低，伸展状态，着色浅 常染色质是进行活跃转录的部位。 异染色质(heterochromatin)：压缩程度高，聚缩状态，着色深 结构异染色质(constitutive heterochromatin) 兼性异染色质(facultative heterochromatin) 没有基因转录表达。 异染色质化可能是关闭基因活性的一种途径。 用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。,二、DNA水平上的调控,13,存在于“灯刷型”染色体（lamp brush）上的环形结构可能与基因的活性转录有关，它是染色体充分伸展时的一种形态。 高倍电镜下观察发现，灯刷型染色体上存在许多突起的“泡”状或“环”状结构，有时还能看到RNP沿着这些突起结构移动，表明这些DNA正在被RNA聚合酶所转录。,14,15,2)基因扩增(gene amplification ),定义 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。 作用 满足特定阶段生命活动的需要,16,为满足正常的生长发育需要 如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增: 卵母细胞中的rDNA拷贝数比体细胞中增加了4000倍，用于转录合成卵裂期所需要的1012个核糖体。一旦卵母细胞成熟，多余的rDNA就没有用了，将被逐渐降解。 在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳蛋白的卵壳基因的扩增 外界环境因素引起基因扩增 基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含myc 原癌基因的DNA区段扩增10200倍。许多致癌剂可诱导DNA扩增。,17,3)基因重排和变换,基因重排(gene rearrangement): 定义 改变基因组中有关基因序列结构 (片断水平的拼接)，使相距很远的片断靠近 作用 调控基因差别表达,18, 免疫球蛋白,19,20, 基因的变换 酵母的交配型（mating-type） MATa等位基因的细胞就叫做a型细胞； MAT等位基因的细胞就称为型细胞。 （相当于高的生物的雌性和雄性） 不同菌株相互接合才能产生二倍体的合子。相同的交配型之间是不能接合的。,21,22,交配型的转换 某些品系的酵母具有转换（switch）交配型的能力，即从a型变成为型，或从型转变为a型。这些品系带有显性等位基因HO，并频繁地改变它们的交配型（常常每代改变一次）。 转换的存在表明所有的细胞都含有MATa和 MAT型的潜在信息， MAT和MATa同在一条染色体上，MAT样基因HML位于MAT的左边，MHR位于MAT的右边。,23,24,暗箱模型（cassette model） MAT是活性暗盒（active cassette），可以是型，也可以是a型。HML和HMR是沉默暗盒（silent cassettes），都不能表达，通常HML带有暗盒，而HMR带有a暗盒，所有的暗盒都带有编码交配型的信息，但只有MAT可以表达。当活性暗盒信息被沉默暗盒信息所取代时就发生了交配型转换。新“装进”活性暗盒的信息就可以表达。 转换是按重组进行的。,25,4)染色体(质)丢失(chromosome diminution ) 或基因丢失 在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染色体。 例如在马蛔虫（Parascaris equoorum）胚胎发育过程中，有27DNA丢失。在高等动植物中，尚未发现类似现象。,26,小表瘿蚊（Mayetiole destructor）受精卵的细胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞体（syncytium）。当核第3次分裂后，有两核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极细胞质，在极细胞质中的核保持了全套的染色体（2n =40），将来分化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，染色丢失了32条，只保留8条，将来分化为体细胞。,27,28,5) DNA的甲基化与去甲基化 A 甲基化 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,可能存在于所有高等生物中，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化诱导了基因的重新活化和表达 DNA甲基化的主要形式：CpG、CpXpG、CCA/TGG和GATC,29, CG islands 高等真核生物中包含未甲基化CpG双核甘酸序列通常成串出现在随时准备好转录或转译的脱氧核糖核酸中，这段序列称为CG岛。,30,31, 甲基化酶 日常型（mainteance） 有模板 从头合成型（ denovo synthesis）,32, 在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度 很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较 低. 去甲基化又可使基因恢复活性。,卵黄原蛋白基因5调节区,雌激素结合位点,33,B、 DNA甲基化抑制基因转录的机制 甲基化抑制基因转录的直接机制- 直接干扰转录因子结合位点的转录,34,甲基化抑制转录的间接机制,甲基化以后改变染色质的构象或者通过与甲基化CpG结合的蛋白因子（ MeCP1、MeCP2 ）间接影响转录因子与DNA结合。 甲基化达到一定程度会发生从常规的BDNA向ZDNA的转变。,35,甲基化提高了突变频率,36,C、 DNA甲基化与X染色体失活 在生殖细胞形成或胚胎发育过程中DNA的甲基化修饰是引起父源和母源基因活性差异的关键。 高度甲基化的等位基因常不被表达或表达活性减低，称为被印迹的基因。如果在卵子形成过程中被印迹，就会在后代细胞中表现出来自母方的该基因 “沉默”，称为母源印迹；若在精子形成过程中被印迹，则来自父方的该基因表现“沉默”, 称为父源印迹。,37,目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。,38,印记基因与疾病 印记丢失（loss of imprinting） 在许多遗传性疾病中存在遗传印迹的现象。如亨廷顿舞蹈病属于常染色体显性遗传病，若由父源传递，则子女的发病年龄提前，临床症状加重，除舞蹈动作外，还出现神经系统功能紊乱。 近年提出，IGF2或 H19 的印迹丢失(loss of imprinting, LOI ), 即被印迹的非活性等位基因重新激活，是肿瘤发生的一种新机制。,39,三、转录水平上的调控,真核生物的调控也主要发生在转录水平上，受大量特定的顺式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（trans-acting factor）的调控，大多数真核生物的转录调控是通过两者的相互作用来实现的。,40,（一） 顺式作用元件 真核生物DNA序列（非编码序列）和被转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。 A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子,41,42,A 启动子（promoter）,包括核心启动子和上游启动子，在转录起始点上游约100200bp以内，每个元件长度约为720bp，决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件。,43,a 核心启动子（core promoter） 保证RNA聚合酶转录正常起始所必须，包括转录起始位点和TATA盒。 核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。,44,b 上游启动子元件（upstream promoter element，UPE） 包括CAAT盒和GC盒等，能通过TFD符合物调节转录起始的频率，提高转录效率。,45,46,B 增强子(enhancer) 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 没有增强子 启动子不表现活性 没有启动子 增强子无法发挥作用,47,特点： 1、增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。 2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距3 kb，或在基因下游，均表现出增强效应； 3、必须有两个(以上)增强子成份紧密相连，enhanson. 4、增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能； 5、促进转录，不具有启动子专一性； 6、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,48,49,50,增强子可能有如下3种作用机制： 影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录； 将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动； 增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的“入口”。,增强子的作用原理是什么呢？,51,C 沉默子(silencer) 负性调节元件，与相应的反式因子结合后，可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。 这类特定序列不受距离和方向的限制，但机理目前尚不清楚。,52,53,四、反式作用因子,能直接或间接识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。,54,真核生物的RNA聚合酶不能识别DNA上的结合位点，识别这些序列的是调节转录的反式作用因子，即转录因子。 但有些转录因子是识别并结合其它转录因子以形成转录装置的必需蛋白。,55,56,57,反式作用因子根据各个蛋白成分在转录中的作用分为3部分： 参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。 与转录的起始或终止有关的辅助因子，不具有基因特异性。 与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合物的一部分，因为所有或大部分基因的启动区都含有这一特异序列。更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。,1、 类型,58,按功能特性分 基本转录因子(general transcription factors) 是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种转录的类别。如： TFA、 TFB、 TFD、 TFE等 特异转录因子(special transcription factors) 个别基因转录所必需，决定该基因的时间，空间特异性。如: OCT-2：在淋巴细胞中特异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。,59,2、 反式作用因子结构, 三个功能结构域： DNA识别结合域(DNA-binding domain)； 转录活性域(transcriptional activation domain)； 结合其他蛋白的结合域,60,反式作用因子通过以下不同的途经发挥调控作用： 蛋白质和DNA相互作用； 蛋白质和配体结合； 蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的修饰 正调控与负调控,61,62,63,64,3、反式作用因子DNA 结合域结构模式,65,HTH, Helix-turn-helix,2个螺旋被一个转角隔开 识别螺旋，与DNA在大沟中特异结合 穿过大沟，与DNA非特异结合,S386,66,许多调控蛋白都有HTH,阻遏蛋白和CAP等,67, Zinc finger,、Cys2/His2, 经典 23aa Cys- X2-4- Cys-X3-Phe- X5 -Leu- X2 -His- X3 -His Cys，His与Zn+结合形成4面体结构，使中部的氨基酸回折成环，凸出如手指 中部芳香族氨基酸保守，疏水 串联重复排列，两指间7-8aa 锌指数目多少不等,S395,68,SP1（与RNA聚合 酶作用的广泛 作用因子）,zyj271,69,TF IIIA,344aa，N端与DNA结合 9个锌指，每个30aa 与5s rRNA基因内启动子50bp)结合,70,71,、Cys2/Cys2 zinc finger,Cys- X2- Cys-X13Cys- X2- Cys Zn+与4个Cys结合 DNA结合序列较短，对称 无大量重复性锌指 Cys2/Cys2与 Cys2/His2不同 例如GAL4，酵母的转录因子 哺乳类的固醇类激素受体,72,糖皮质激素受体,ZYJ272,73,-COOH，每隔7个氨基酸出现一个Leu，所有Leu出现在同一侧面，成直线排列，形成疏水面,-NH2,富含碱性氨基酸，碱性DNA结合域,Leu zipper,依靠Leu的疏水作用,2个helix 相互缠绕，形成拉链结构,74,GCN4,75,在真核生物中广泛存在,C/EBP 增强子结合蛋白 GCN4 酵母激活因子 CREB（cAMP应答元件结合蛋白） 原癌基因jun, fos编码产物,Leu拉链可以homodimer, heterodimer起作用，说明用各种不同组合，可产生不同的调控蛋白，能阅读多种序列（功能的灵活性）,76,bHLH （ Helix-loop-helix）,4050aa 含2个-helix（1516aa）, 由连接区（1228aa）连接；两亲性（amphipathic）；通过疏水面作用形成二聚体 NH2端为碱性结合区，16aa,77,MyoD-DNA,78,缺乏碱性区的蛋白质，即使形成（同、异）二聚体，也无法同DNA结合,zyj278,79,4、 转录活化结构域,一般由20-100个氨基酸残基组成。如GAL4分子中有2个这种结构域，分别位于多肽链的第147-196位和第768-881位；GCN4的转录激活结构域位于多肽链的第106-125位。,80,a. 带负电荷的螺旋结构 【酸性-螺旋(acidic -helix) 】 该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性-螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。 增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平。可能是通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。,81,b. 谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain) SP1的N末端含有2个主要的转录激活区（GC盒），氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳动物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。 c.脯氨酸丰富区(proline-rich domain) CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基。,82,五、真核基因转录调控机制,基因转录的调控需要 顺反因子、蛋白质之间的相互作用 （一）顺式元件与反式作用因子的相互作用 1 调控模型 调控蛋白以多聚体（2,4）结合,83,Y277,84,2、蛋白质如何识别DNA特定序列？,蛋白质的识别螺旋嵌入DNA大沟中 非特异性结合：结合部位附近的正电区域（由带正电的氨基酸侧链组成），与DNA主链的PO4离子产生静电作用，二者距离远，作用弱 特异性结合：当到达靶位点时，蛋白质分子上特定位点上的H供体和受体的空间取向正好于DNA靶位点互补，结果形成氢键，使二者距离缩短（1.01.5nm），作用力增强106倍 这种寻找方式比在DNA上跳动能更迅速地找到靶位点,85,调控蛋白识别DNA采用的HTH模式具有普遍性,S390,86,（二）cis-factor 互作的模式,Looping hypothesis：位于2个不同的DNA结合位点上的2个蛋白质，可以通过2个结合位点之间的DNA形成loop得以相互作用，影响基因转录 实验证据： Gal operon Ara operon SV 40 早期启动子 Enhancer，见下页,87,88,89,蛋白质磷酸化与去磷酸化是生物体普遍存在的信息传导方式，涉及到所有的生理和病理过程。 糖代谢，光合作用，细胞生长发育，神经递质的合成和释放甚至癌变。,（三）蛋白质磷酸化对基因转录的调控,（四）蛋白质乙酰化对基因表达的影响,组蛋白乙酰化和去乙酰化：赖氨酸乙酰化有利于转录 P53乙酰化和去乙酰化：乙酰化促进把基因的转录,90,（五）诱导型转录因子活性调控 -热休克应答,91,1 HSP（heat shock protein) aa序列高度保守 蛋白质功能高度保守 是一种分子伴侣chaperone,2 hsp 核苷酸序列高度保守，如人与E.Coli4060 多基因家族，多拷贝，成簇存在 大部分无内元，如hsp70，转录后不须剪切即可产生成熟mRNA，适应需要,92,HSE, heat shock element,位于hsp上游 核心序列nGAAn，首尾排列 GAANNTTCNNGAA 保守 ，几乎存在于所有的HSP中。把HSE连接在其它基因的上游，该基因可获得热诱导性。HSE在进化中的保守性是热休克应答普遍性的分子基础之一,93,HSF, heat shock factor， HSE 结合蛋白，热激转录因子,DNA结合区：3个螺旋，形成疏水区 多聚化区：4个Leu拉链，三聚体有活性 C末端（452488）保守区,94,热休克应答的 调控机制,常温下，HSF在体内以单体存在，不与DNA结合（无活性） 这是由于拉链1,4相互作用，加上Hsp70, hsp90的共同作用，使HSF保持单体,热激后，大量变性和 错误折叠的蛋白质出现, 与Hsp70, hsp90竞争结 合,使拉链区暴露, 多聚 化，与HSE结合,95,HSF解离，形成HSF单体,多聚化,与HSE结合,产生HSP,HSP积累，可与HSF结合,脱离HSE,热激,96,shen256,热休克应答现象普遍存在 热休克基因家族是迄今被发现的最保守的遗传系统 热休克反应可被多种因素诱导，应激反应,97,六、转录后水平调控,1、 hnRNA选择加工及运输 实验发现，在海胆囊胚细胞中，约有2万种不同序列的hnRNA，其中1.3万种加工形成mRNA；在成体肠细胞中，约有2.5万种hnRNA，只有3000种加工成mRNA。在囊胚中存在，而肠细胞中没有的mRNA序列。 说明海胆中许多基因的转录并不因组织的不同而有很大的差异。不同组织调控自己mRNA水平的主要方式似乎不在转录水平，而在对hnRNA的选择加工，似乎只有一小部分基因的调控发生在转录水平。,98,除了转录水平调控外，mRNA水平还决定于hnRNA加工、mRNA运输，但对其机制了解不多,hnRNA 核内不均一RNA hnRNP 与RNA结合蛋白形成核糖核蛋白,蛋白质3/4 加工 5-capping, 3-polyA, splicing ，RNP复合物中的蛋白质组分可能包含了各步骤所需的酶 mRNA ,mRNP 在细胞质中与蛋白质结合存在,这些蛋白质只与mRNA结合，,99,2、alternative splicing,概念 组成型拼接: 一个基因的mRNA前体按一种方式剪切，产生一种mRNA，一种蛋白质 选择性拼接：有些基因的mRNA前体，按不同方式剪切，产生两种以上mRNA，翻译产生多种蛋白质 产生原因及类型 有两个以上的启动子, 未发现实例 有多个加尾信号, 如免疫球蛋白 选用不同的拼接位点，如SV40的T,t抗原 几者兼有，如大鼠降钙素基因相关产物,100,果蝇，性别决定,101,免疫球蛋白, 不同3末端型,102,S366,大鼠肌钙蛋白T基因,103,大鼠降钙素,calcitonin,ylf420,Calcitonin gene related peptide,Y420,104,调控机制,实质是5供体与3受体拼接点的选择搭配 如何选择不同的位点？ SR蛋白家族：SF2剪接因子，可与RNA结合，决定5剪接位点RNP的调节：hnRNP-A1, U5-snRNP,105,Intron的功能之一是使同一个基因表达出多种蛋白质，即扩大DNA中遗传信息的含量 高等真核生物基因组很大，完全能容纳更多的基因。为什么一方面它的许多基因非常分散，而另一方面它又使一个基因产生出多种产物？,选择性剪接的意义,令人不解 ！？,106,由于可变剪接机制的多样化，一个基因可以在转录后通过hnRNA的剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。因此基因的定义也应随之扩展，即不应以多肽产物为单位，应以独立转录的一段DNA作为确定一个基因的标准？,107,9.5.3 RNA editing,RNA编辑是指遗传信息在mRNA水平上发生改变的过程 。即RNA的编码序列与转录产生它的DNA序列不同。,108,RNA编辑相继在真核生物和病毒中发现 如小鼠脑中的谷氨酸受体，哺乳动物载脂蛋白B，植物线粒体中的细胞色素氧化酶亚基 editing signal? editosome structure? 生物学意义 生物适应中的保护措施之一 中心法则的发展：改变DNA的信息，使DNA abbreviated, 称为cryptic gene（隐藏基因）。,109,七、翻译水平的调控,1 翻译起始因子的磷酸化 2 mRNA结构 3 mRNA稳定性 4 pro.合成的自体调控,例，转铁蛋白mRNA的翻译调控,110,（1）TfR (transferrin receptor), 用于铁的运输 铁含量高时， TfR合成减少 低时， TfR合成增加 IRE, 在3-UTR区, 与IRE-BP结合稳定mRNA,111,（2）Ferritin，铁蛋白，用于铁的解毒 铁含量高时， ferritin合成增加 低时，ferrit