糖的组织化学.ppt

组织化学 histochemistry 特殊染色, 通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂,定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分,同时又能保存原有的形态改变, 达到形态与代谢的结合. 可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸、某些金属元素等。,糖 的 组 织 化 学,糖的分类,单糖和双糖 多糖：淀粉、纤维素、糖原 粘液物质（粘多糖） 中性粘多糖 酸性粘多糖 糖蛋白 粘蛋白 氨基己糖4% 糖蛋白 氨基己糖4% 5. 糖脂 含有半乳糖, 脂肪酸,神经氨基醇,糖 原,一. 糖原的概念,由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内的多糖 分布：胞浆内 肝、心肌、骨骼肌 同种葡萄糖的聚合物 作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片,二.固定剂的选用,Carnoy（冷4） 无水乙醇 60ml 防止糖原溶于水 氯 仿 30ml 增加渗透力 冰 醋 酸 10ml 抵消乙醇对组织的 收缩、硬脆作用 *优点：固定迅速，保存肝糖原,2. Gendre （冷4） 苦味酸无水乙醇饱和液 80ml 甲醛 15ml 冰醋酸 5ml 临用前混合配制,3. Lillie固定液（AAF） 无水乙醇 85ml 冰醋酸 5ml 甲醛 10ml 固定液预冷4，固定24h后，95%乙醇脱水，包埋,三.固定中注意事项,1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液 2.应用含酒精的溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳 3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质膜保护起来，,四.显示糖原的方法,1. 碘染色 2. 胭脂红染色 *3. 过碘酸-Schiff 反应 4. 银浸染法,过碘酸-Schiff 反应,Periodicacid-Schiff, PAS,(一）染色原理,过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上的羟基（-OH）变为醛基（-COOH）,Schiff氏试剂是付品红（碱性品红）经SO2作用后，形成的无色溶液,付品红,Schiff试剂,当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀,*PAS反应的基本原理 1. 通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基 2. 醛基与Schiff试剂反应显出红色沉淀,(二) 染色步骤,1.切片脱蜡至水 2.1%过碘酸溶液内氧化5-10min 3.流水洗5min, 再用蒸馏水洗 4.用Schiff试剂处理10-20min 5.流水洗10min 6.复染(可用Mayer明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核) 7.脱水、透明、封片,切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%的过碘酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。,切片充分洗净后入Schiffs试剂中进行显色。作用15分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。,肝糖原-PAS染色 X200,肝糖原- PAS+苏木素复染 X200,【结果】 胞浆内PAS阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色 红色深浅反应含糖原量的多少 【对照】 采用淀粉酶或唾液酶消化切片 对照片PAS（-），未处理片（+）,This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes. The capillary loops of the glomerulus are well-defined and thin.,A888 kidney 11-PAS,A888 kidney 14-PAS,（三）PAS反应的应用,证明与鉴别细胞内空泡样变性 （水变性、脂肪变性、糖原） 心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究 糖原累积病的诊断及研究 糖尿病的诊断及研究 某些肿瘤的诊断与鉴别,肝细胞水变性,肝脂肪变性 (石蜡切片),肝脂肪变性 (冰冻切片),脂肪特染：苏丹III,糖原累积症,PAS（+） PAS（-） 肝细胞癌 胆管癌 横纹肌瘤 颗粒细胞肌母细胞瘤 Ewing肉瘤 骨的网织细胞肉瘤,（四）注意事项,1.过碘酸溶液与Schiff试剂均可反复使用多次，用后密封放入冰箱4保存 2.新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，刚配成的作用时间短，以后逐渐延长 3.过碘酸溶液在作用前应与室温接近，温度太低，造成氧化不全，影响效果 4. Schiff试剂如呈淡红色，则应弃去重配,5. Schiff试剂配法很多，区别不大，可以随意选用 6. Schiff试剂作用时，染色缸必须加盖，不然Schiff试剂将因SO2消失而失效,Schiff试剂,碱性复红 1g 1N盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠 1g 重蒸馏水 200ml,粘 液 物 质 (粘 多 糖),人体的各种腺体及其他许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为粘多糖 或粘液,分类,中性粘多糖 酸性粘多糖 1.硫酸化粘液物质 结缔组织 （强） 上皮 （弱） 2.非硫酸化粘液物质 含己糖醛酸的结缔组织粘液物质 含唾液酸的上皮粘液物质,粘液物质染色在诊断中的应用,用于一般粘液性病变的观察 肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的染色方法进行观察和鉴别,胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液 -AB-PAS染色区分中性与酸性粘多糖 酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不同的PH值及不同的电解质浓度，可以区别酸性粘多糖的二种基团 -HID-AB法,不同PH的竞争性抑制 PH2.5时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色 PH1.0时，仅硫酸粘多糖着色,2.电解质浓度与粘液物质着色的关系,MgCl2浓度 显示物 0.06M 羧酸和硫酸化粘液 0.3M 弱和强硫酸化粘液 0.5M 强硫酸化粘液 0.7M 强硫酸化结缔组织粘液 0.9M 硫酸角质,显示糖分子和酸性基团的 组化方法,1.奥蓝-过碘酸Schiff氏法（AB-PAS）,【目的】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义,【染色原理】,奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。 AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与PAS发生反应；仅中性粘多糖为PAS阳性,【染色步骤】,1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗 2.1%奥蓝的醋酸（3%）液染30分钟（PH约2.5） 3.蒸馏水洗 4.1%过碘酸液氧化5-10min 5.蒸馏水洗 6.Schiff试剂作用10-30min 7.流水洗10min 8.脱水，透明，封片,Alcin blue染色液： 奥蓝1g，蒸馏水97ml，冰醋酸3ml 临用前过滤使用，调节PH2.5-3之间 【结果】 中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色,AB-PAS X100,AB-PAS X200,2.高铁双胺-奥蓝法（HID-AB）法,【目的】 主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值 正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性粘液 小肠氮乙酰化唾液酸粘液 大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液,肠型胃癌 唾液酸粘液 硫酸粘液 弥漫型胃癌 中性粘液 高分化腺癌 硫酸粘液 中低分化腺癌 唾液酸粘液 大肠型化生 硫酸粘液 小肠型化生 不含硫酸粘液,高铁双胺染液,N，N-二甲基-间-苯二胺二盐酸盐 120mg N，N-二甲基-对-苯二胺二盐酸盐 20mg 溶于预热至25的蒸馏水50ml中，再加入60% FeCl3.6H20 1.5ml (PH1.4-1.5),【染色原理】,二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。 该反应缓慢，需加入FeCl3作为催化剂 FeCl3的作用 -使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色 -使染色液的PH降至1.4 以后奥蓝（PH2.5）把羧基化的唾液酸粘液染成蓝色,