突发传染病的实验室诊断.ppt

突发传染病的实验室诊断,全球预警和最新消息,埃博拉疫情 新华社雅加达11月4日电 印度尼西亚研究人员在加里曼丹岛的红毛猩猩体内发现埃博拉病毒。 埃博拉病毒通常由血液和其他体液传播，可以通过接触传染，传播速度很快。这种病毒是人类迄今所发现致死率最高的病毒之一，目前尚无有效疗法。,裂谷热疫情,世界卫生组织11月1日证实，非洲国家毛里塔尼亚自今年9月中旬起暴发裂谷热疫情，截至10月30日，该国共报告34个病例，17人死亡。 裂谷热是一种病毒性人畜共患疾病。,登革热疫情,世界卫生组织报告，葡萄牙近期暴发登革热疫情。 登革热由感染了登革热病毒的伊蚊通过叮咬传播，人感染后3天14天会出现症状。 澳门特区政府卫生局5日证实，再接获1名新增登革热本地病例报告，包括之前的14例病例，澳门至今已累计录得15例登革热确诊病例。,变异型H3N2流感病毒,美国疾病预防控制中心报告，截至2012年8月31日，美国共有301个猪传人的变异型H3N2流感病毒(H3N2v)病例报告，其中2011年11个，2012年截至8月31日289个。在2012年7月至8月期间，共有15名病人需住院，1名病人死亡。 感染个案症状和严重性类似季节性流感,新型冠状病毒,世界卫生组织报告，发现两例与新型冠状病毒感染有关的病例，两名患者都曾在沙特阿拉伯逗留。 国际旅行和出入境健康提示-新型冠状病毒感染的预防,传染病流行,传染病在人群中发生流行的过程，即病原体从感染者排出，经过一定的传播途径，侵入易感者机体而形成新的感染，并不断发生、发展的过程。 传染病在人群中发生流行需要三个基本条件，也称三个环节，即传染源、传播途径和易感人群。,实验室检测 快速 准确 简便 大样本,重点传染病-有国家规划或项目覆盖的病种 艾滋病、肺结核、血吸虫病以及疟疾、包虫病、布病等 确定控制目标和策略 强有力的国家规划和国际项目 国家免疫规划针对传染病 “五苗七病”基础上增加到15种传染病 维持无脊髓灰质炎状态、消除麻疹 逐步纳入新的疫苗可预防传染病 重点监控传染病 鼠疫、霍乱、SARS、HPAI 等 发现个别病例，即采取强力控制措施，以防播散 其它传染病 监测与暴发的预防控制 建立地区性控制项目或规划 新发传染病 提高监测和识别能力 提高应对能力，加强应对准备 降低发生风险,我国传染病预防控制的策略框架,实验室诊断策略,免疫学诊断技术 AgAb 质谱分析技术、纳米技术、生物传感器技术,分子诊断技术 DNA/RNA,一、免疫学诊断技术,1、抗原的基本特性 免疫原性和抗原性 2、抗体特性： 1）特异性结合抗原 2）激活补体 3）结合细胞 4）可通过胎盘及粘膜 5）抗原性 7）Fc受体 3、抗原抗体反应的三大特征 特异性、比例性、可逆性,1、酶联免疫吸附试验（ELISA）,2011年诺贝尔奖免疫活化的关键原理,2011年度诺贝尔生理学或医学奖授予Bruce A. Beutler, Jules A. Hoffmann an和Ralph M. Steinman.,ELISA技术在传染病诊断的应用,血清中抗原抗体的检测 双抗原夹心法用于检测HIV抗体 双抗体夹心法检测HBsAg、间接法用于检测HCV抗体等,2、免疫层析诊断技术,胶体金的标记 硝酸纤维膜（NC膜）层析技术 免疫层析诊断技术 快速、操作简单、稳定性好、成本低 灵敏度低于ELISA,胶体金免疫层析技术在传染病诊断的应用,常规的乙肝五项检测项目 HCV抗体、HIV抗体等检测项目 甲型H1N1流感抗原胶体金试剂,3、化学发光技术,化学发光（chemiluminescence）：又称为冷光，它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下由化学反应而产生的光辐射。 常见的化学发光剂和化学发光体系： 鲁米诺 过氧化草酸酯 酸性高锰酸钾 四价铈 吖啶酯化合物,鲁米诺早在1853年就被合成出来了。1928年，化学家首次发现这种化合物有一个奇妙的特性，它被氧化时能发出蓝光。,刑侦学应用 在检验血痕时，鲁米诺与血红素hemoglobin，发生反应，显出蓝绿色的荧光。这种检测方法极为灵敏，能检测只有百万分之一含量的血。,化学发光技术在传染病诊断的应用,化学发光分析法结合ELISA技术 国内企业：乙肝 HBsAg、HCV抗体、HIV抗体试剂获准上市 法国生物梅里埃公司的HIV抗原抗体联合检测试剂VIDAS HIV Duo、VIDAS HIV Ultro已在我国获准上市 罗氏诊断的HIV抗原抗体试剂,4、时间分辨免疫荧光分析法,芬兰的Wallac公司建立，其标记物为Eu3+标记的抗原或抗体，在荧光增强液的作用下，抗原抗体复合物上结合的Eu3+离子从免疫复合物解离，迅速与荧光增强液中的配体整合并进入疏水内核，使得半衰期较长的Eu3+荧光得以成千万倍的放大，从而产生高灵敏度的免疫分析。,时间分辨荧光免疫分析法在传染病诊断的应用,国内两家企业，HBsAg、HCV抗体、HIV抗体试剂等获准上市。,5、免疫组织化学法,免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。,二、分子生物学诊断技术,分子生物学诊断技术：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术。分子诊断的材料包括DNA、RNA核酸。 常规技术种类 1）聚合酶链式反应（PCR）； 2）DNA测序（DNA sequencing）； 3）荧光原位杂交技术（FISH）； 4）DNA印迹技术（ DNA blotting ）； 5）单核苷酸多态性（SNP）； 6）连接酶链反应（LCR）； 7）基因芯片技术（gene chip）。,聚合酶链式反应,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 1995年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。,1995年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。 心灵裸舞,应用于传染病诊断的分子生物学技术,靶序列的扩增 DNA/RNA PCR/RT-PCR（DNA） NASBA(RNA) LAMP(DNA) 信号扩增 bDNA技术,RT-PCR,N基因RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 M：DNA marker DL2000； 1：PCR product of SARS-N gene form gargle； 2：PCR product of SARS-N gene form lung tissue； 3：PCR product of SARS-N gene form spleen tissue。,bp 2 000 1 000 750 500 250 100,M 1 2 3,1287bp,pcdna3.1-N sep,NASBA,三、纳米技术,纳米技术的迅速发展也为微生物诊断提供了重要的手段。如用固相纳米粒子结合四色荧光进行超速的DNA测序。 纳米生物芯片和微阵列用于微生物鉴定。 纳米共聚焦分光镜分辨微生物感染细胞。 用荧光标记的纳米量子点(QD)检出细胞内病毒或其他微生物。 量子点技术快速检测HCV核心抗原。,四、生物传感器技术,国际上用生物传感器技术检测环境(空气、饮用水、食品等)中的微生物已取得巨大进步。 常用的传感器有电化学、压电、光学传感器等。 基本原理是在金属膜上识别与检测能起相互作用的物质发生信号变化。表面等离子体谐振(surfase plasmon resonesonance，SPR)生物传感器技术。 SPR技术在金属膜或芯片上固定标记的特异性核酸探针与被检的核酸结合后，入射光作用下发生共振信号，仪器检测到其反应动力学的参数。 已有报告用SPR芯片检测常见病原微生物，包括：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌，脲原体及人乳头瘤病毒等，与培养的结果一致。用此技术也可检测金黄色葡萄球菌的肠毒素B。,五、宏基因技术等,宏基因组学也称环境基因组学或群体基因组学，是利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生物有机体群落，而不需要分离培养成单一的微生物。 宏基因组学为研究微生物生态学、微生物与环境的关系、微生物间的关系及感染形成的原因具有重要的价值。,原位杂交技术,肺组织免疫电镜（ 18nm 135 000 ）,肺组织SARS-N蛋白原位杂交,病毒分离技术,流感病毒分离,鸡胚尿囊腔接种法 病毒的动物接种法小白鼠脑内接种,国内快速诊断研究趋势,埃博拉病毒,埃博拉病毒可在人间造成严重的病毒性出血热疫情。 病毒性出血热疫情的病死率高达90%。 埃博拉出血热疫情主要发生在中非和西非靠近热带雨林的边远村庄。 该病毒通过野生动物传播到人，并且通过人际之间传播在人群中蔓延。 大蝙蝠科果蝠是埃博拉病毒的自然宿主。 无论对人还是对动物都没有治疗办法或者疫苗。,埃博拉出血热重大疫情年表（截至2012年5月）,埃博拉病毒实验室检测,酶联免疫吸附试验（ELISA） 抗原检测试验 血清中和试验 逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR） 通过细胞培养进行病毒分离 检测取自病人的样本具有极端生物危害风险，只有在最高级别的生物防护条件下才可进行操作。,症状和体征,埃博拉出血热是一种严重、急性病毒性疾病，其特征往往是起病急，有发热、极度虚弱、肌肉疼痛、头痛和咽喉痛症状。随后会出现呕吐、腹泻、皮疹、肾脏和肝脏功能受损，某些情况下会有内出血和外出血。化验结果显示白血细胞和血小板计数降低，而肝酶则会升高。 人的血液和分泌物中含有病毒时就会具有传染性。实验室获得性病例在起病后高达第61天时，仍从其精液中分离到了埃博拉病毒。 潜伏期（从获得感染到出现症状的时间间隔）从2天至21天不等。 发生埃博拉出血热疫情时，病死率在不同的疫情之间存有差别，处于25和90之间。,裂谷热,裂谷热是一种病毒性人畜共患病，主要影响的是动物，但也能传染人。传染可导致人畜患染严重疾病。该疾病因裂谷热感染的牲畜死亡和流产，也会造成重大经济损失。 绝大多数人间感染是与受感染动物的血液或器官直接或间接接触所造成的。 有证据显示，人若摄入未经高温消毒或未煮过的被感染的动物的奶，也可能感染裂谷热。 受感染蚊子叮咬也会导致人间感染，通常是伊蚊叮咬。 嗜血（食血）苍蝇也有可能传播裂谷热病毒。 迄今尚无文件证明有裂谷热在人间传播的病例，在采取了标准感染控制预防措施后，也未见有关裂谷热传播给卫生保健人员的报道。 没有证据显示在城市地区暴发裂谷热。,裂谷热的实验室检测,急性裂谷热可采用不同方法进行诊断。 酶联免疫分析一类的血液检测（ELISA），可证实存在特异性IgM病毒抗体。 采用各种不同方法，包括病毒传播（在细胞培养或接种过的动物身上）、抗原检测试验和扩增核糖核酸基因组（RT-PCR），在发病早期阶段或在尸体解剖组织中，均可检出此种病毒。,临床症状,人体轻度感染裂谷热症状： 裂谷热潜伏期（从感染到出现症状）为2至6天。 受感染者一般无任何检出症状，也可出现轻度的疾病反应，有发烧症候，即突然感冒发烧、肌肉疼痛、关节疼痛和头痛。 一些患者出现脖子僵硬、畏光、食欲减退和呕吐症状；这些人在发病初期可能会被误诊为脑膜炎患者。 裂谷热症状通常持续4至7天，此后通过抗体出现即可检出免疫反应，血液中的病毒也随之逐渐消失。 人体重度感染裂谷热症状： 尽管大多数人间病例病情相对较轻，但仍有少数患者出现相当严重的症状。通常会出现三种明显综合征中的一种或多种症候：眼部（眼睛）疾病（0.5-2%的患者）、脑膜炎（不到1%）或出血热（不到1%）。 不同流行病的总的病例致死率差异很大，但总体来说，记载的这些致死率不到1%。大多数死亡是有出血性黄疸症状的患者。,治疗和疫苗,由于大多数裂谷热人间病例病症相对较轻且持续期短，这类患者不需要任何特定的治疗。对于较为严重的病例，主要的治疗方法是一般支持性疗法。 现已开发出一种用于人体的灭活疫苗。不过，此种疫苗没有获得许可证，因而尚未投放市场。作为实验，它用于保护有接触裂谷热极大危险的兽医和实验室人员。目前正在对其他候选疫苗进行研究。,登革热和登革出血热,登革热是一种蚊媒病毒感染。 感染导致流感样症状，有时还会发展为可能致命的并发症，称为重症登革热。 近几十年全球登革热发病率大幅度增长。 现在，约有一半世界人口面临登革热的危险。 登革热发生在全球热带和亚热带气候地带，多在城市和半城市地区。 重症登革热在亚洲和拉丁美洲一些国家是导致儿童严重患病和死亡的一个主要原因。 对登革热/重症登革热没有特异治疗办法，但及早发现和适宜的医护可将死亡率降到1%以下。 预防和控制登革热取决于有效的病媒控制措施，包括个人防护、持续的病媒控制措施和化学控制。,临床症状,登革热是一种严重流感样疾病，影响婴儿、幼儿和成人，但极少引起死亡。 如果高热（40C）伴随以下症状中的两种，则须考虑登革热：严重头痛、眼球后疼痛、肌肉和关节痛、恶心、呕吐、腺体肿胀以及出疹。症状通常在被感染蚊子叮咬之后经4-10天潜伏期后出现，持续2-7天。 重症登革热是一种有可能因血浆渗漏、积液、呼吸窘迫、严重出血或器官损伤导致死亡的并发症。最初症状出现3-7天后会在温度（38C）下降的同时出现一些预警迹象，包括：严重腹痛、持续呕吐、呼吸急促、牙龈出血、全身乏力、烦躁不安、呕吐物带血。随后24-48小时为治疗关键阶段，患者可能死亡，需要进行适当医护处理以避免并发症和死亡风险。,登革热的实验室诊断,病毒分离：将急性期患者血清接种于新生（13日龄）小白鼠脑内、猴肾细胞株或白纹伊蚊胸肌内分离病毒，第1病日阳性率可达40%，以后逐渐减低，在病程第12d仍可分离出病毒。最近采用白纹伊蚊细胞株C6/36进行病毒分离，阳性率高达70%。 补体结合试验分型，可达到快速诊断的目的。 RT-PCR：在病毒感染后5-6小时即可诊断，在病毒感染2日内可进行病毒分型，具有敏感性高、特异性强、检测时间短等优点，但易出现假阳性，未在临床广泛应用。,治疗和疫苗,没有针对登革热的特异治疗方法。 对于重症登革热，具有经验，并且了解该病情况和进程的医生和护士可以挽救生命 - 把死亡率从20%多降低到不足1%。重症登革热医护的核心在于保持患者的体液量。 尚没有预防登革热的疫苗。,变异型H3N2流感病毒,流感病毒最初是在1932年分离出来，属于正黏液病毒科的单株成员，据世界卫生组织称，它每年在每个国家按季节或零星出现，导致25万到50万人死亡，另有几百万人因此罹患重症。 实际上，大流行性H1N1病毒已经在猪身上与H3N2病毒重配