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动物实验质量控制,医学科研工作基本程序,医学科学研究就方法来说是提出假说、验证假说的过程。其工作程序是紧紧围绕这条主线进行的。医学科研工作基本程序如下：,提出假说 确定题目,文献检索，调查访问,假说形成，提出设想,陈述问题，开题讨论,安排实验 验证假说,实验设计,实验观察,数据资料积累,总结工作，完成论文 ，拿出成果。,数据资料处理,统计分析,提出结论,医学科研工作基本程序,动物实验,动物实验是根据研究目的，恰当地选用标准的符合实验要求的合格实验动物，根据科学的合理的设计方案，在相应的环境设施中进行各种科学实验并观察、记录动物的反应过程或反应结果。以探讨或检验生命科学中未知因素的专门活动.,动物实验质量控制的意义 动物实验设计中的质量控制 动物的选择 影响动物实验的个体因素 实验技术环节对动物实验效果的影响,一、 动物实验质量控制的意义,现代医学研究的两条基本途径： 临床研究 动物实验 与临床试验相比，动物实验具有独特的特点和优点。,可以将高温、冷冻、缺氧、放射、毒气、致癌物质、烈性传染病等不便施加于人体的有害因素在动物身上进行研究；,根据课题设计安排采样时间、方式和数量，甚至处死动物，最大限度地获取反映实验效应的样本和资料，进行分层次研究；,严格控制实验条件和和影响因素，进行多学科、多指标综合研究，从而使有关过程显现出来； 可以进行反复观察研究，从而发现规律，认识疾病本质，找到解决办法。,动物对实验处理的反应可用如下公式来表示： R = (A+B=C)D+E,R=(A+B+C)D+E,A+B+C,D,遗传因素,环境因素,正相关,A,动物实验成立 的基本条件,B,动物实验的界限,C,因此我们必须对实验结果有影响的多种因素进行控制，以得到一个比较理想的实验结果R。,二、动物实验设计中的质量控制,实验设计是科研计划的具体实施方案,是进行实验和统计分析的先决条件，是实验研究获得预期结果的重要保证。 一个科学合理的实验设计，不仅需要专业方面的理论设计和技术设计，还要考虑统计学要求，合理地安排各种实验因素，严格控制实验误差，从而用较少的人力、物力和时间，最大限度地获得丰富而可靠的资料。,1、规划设计动物实验必须掌握本学科专业知识,熟悉疾病的发病机理、临床体征、治疗用药、疾病转归以及有关检查指标等. 2、规划设计动物实验还要较好地掌握实验动物学的知识，做好实验对象、处理因素和实验效应三个基本要素的设计。,成功的动物实验是将医药学和实验动物学等学科知识有机结合，并使设计合理的课题得到正确实施的结果。,在实验对象上，应正确选择实验动物，重点在遗传因素的控制； 在处理因素方面，除了施加的实验因素和统计处理外，还包括实验环境、微生物和营养等实验条件的质量控制； 实验效应即预期实验结果。,例如研究某种终止早孕药物的作用，实验对象选择早孕大鼠，处理因素则为该药物并进行实验条件质量控制，而实验效应则为早孕终止。,动物实验设计应遵循的原则,动物实验设计是动物实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高实验研究质量的重要保证。,严密而合理的动物实验设计与分组，不仅对实验结果和误差有比较准确的估计，最大限度地获得丰富而可靠的资料，而且还可提高工作效率，避免因实验设计不当而造成人力、物力的浪费，甚至前功尽弃的不良结果。 因此，做好动物实验设计是一项十分重要的工作。,动物实验研究主要是通过对样本的研究而得出结论。要将样本的结论外推到总体，必须尽量使样本能够真实地代表总体。,然而，实验动物的种系和个体差异、实验环境差异、仪器的稳定性、药品的纯度、样本的大小等等因素都可能产生实验误差，影响样本结果的代表性。,为避免或缩小误差，实验设计时必须注意误差控制，遵循如下原则：,对照性原则 一致性原则 重复性原则 随机性原则 客观性原则,1.对照性原则,对照性原则是要求在实验中设立可与实验组比较，用于消除各种无关因素影响的对照组。 实验组和对照组具有同等重要的意义,设置对照组是消除或减少非实验因素的干扰所造成误差的有效措施.没有对照组的实验结果是难以使人信服的.,对照应有可比性,即在“同时同地同条件”下进行。 设立对照的正确方法是把研究对象随机分配给对照组和实验组.,自体对照 对照设立有 两种方式： 组间对照,自体对照是指在同一个体身上观察实验处理前后某种指标的变化,。 也可以把两种实验处理在同一个体身上进行一前一后地交叉比较. 自体对照可有效减少个体差异对试验处理反应的影响.,自体对照,减肥前，体重200kg,减肥后，体重180kg,组间对照是指将若干动物以随机抽样的方法,将其分成若干平行组,随机挑选一组作为实验组,另一组作为对照组,进行比较.,不做任何实验处理或给生理盐水进行比较的对照组叫“空白对照”或“阴性对照”。 实行正常值、标准值处理进行比较的对照组叫“标准对照”或“阳性对照”。,实验组与对照组例数相等时,统计效率最高。,2.一致性原则,一致性原则是在实验中实验组与对照组除了处理因素不同外,非处理因素基本保证均衡一致. 均衡一致是处理因素具有可比性的基础.,3.重复性原则,重复性原则是指同一处理要设置多个样本例数. 重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性,提高实验结果的精确度,同时为体现结果的真实性,保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来,也需要足够的样本数.,样本数过少,实验处理效应将不能充分显示; 样本数过多,会增加实际工作中的困难.因此,在进行实验前必须确定最少的样本例数.既可按一般估测方法确定,也可通过统计学方法进行测算确定。,（1）一般估测的样本数 小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)：每组10-30例,计量资料每组不少于10例, 计数资料每组不少于30例； 中等动物(豚鼠、家兔)： 每组8-20例,计量资料每组不少于8例, 计数资料每组不少于20例； 大动物(犬、猫、猪、羊等)： 每组6-20例,计量资料每组不少于6例, 计数资料每组不少于20例。 （2）按统计学方法测算样本数（见257页）,4.随机性原则,随机性原则就是按照机遇均等的原则来进行分组.其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少,而不受实验者主观因素或其它偏性误差的影响。 随机化的手段可采用编号卡片抽签法、随机数字表或采用计算器的随机数值键等。,5.客观性原则,动物实验设计中力戒主观性干扰,选择观察指标时,不用或尽量少用带主观成分的指标.结果判断要客观,更不能以主观的意愿对结果或数据作任意的改动和取舍.,动物实验数据的统计分析及注意事项,动物实验数据资料经整理和初步统计描述后，须采取相应的统计分析方法进行分析比较，即进行显著性（或差异性）检验。不同类型的数据资料需采取不同的统计分析方法。,统计结论必须与专业结论有机的相结合，才能得出恰如其分、符合客观实际的最终结论。,动物实验设计的基本类型,1、完全随机化设计（completely random design） 完全随机化设计又称成组设计，是将受试对象完全随机地分到各组进行组间比较的一种单因素设计方法。设计时可以分成两组、三组或更多组。,先将动物按顺序编号，再用随机化工具，将动物分组。动物随机分组的方法很多，如抽签、拈阄等形式，但最好的方法是使用随机数字表或计算器。,2、配对比较设计（paired design） 配对比较设计是指实验前将动物按种属、品系、窝别、性别、年龄与体重等有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配到两组中。两组动物的种属、年龄、体重、性别等情况基本相同，取得均衡进行实验，以减少误差及动物间的个体差异，提高实验效率。,3、随机区组设计（randomized block design） 随机区组设计又称配伍组设计，它是配对设计的扩展。该类设计创始于农业试验。随机区组设计不但可以确定处理因素的效果，还可以明辨“区组”的影响。,在动物实验时，可将一窝小鼠或大鼠划为一个区组，确定数个区组后，按区组随机化原则将各区组的动物随机分配到处理组和对照组。,4、单组比较设计（self-comparison design） 单组比较设计是指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化，又称同体比较或自身对照。,例如，用同一批动物处理前后作比较，或用同一批动物的不同部位或不同器官作比较。 此法的优点是能排除个体间生物差异，但同体前后的比较，时间间隔不宜过长，否则受试对象或样品可能因时间间隔过长，受到混杂因素影响或自身发生某种变化，失去同体比较的均衡性。,5、 正交设计（orthogonal experimental design） 正交设计是研究多因素试验的一种设计方法。其特点是利用一套规格化的表格正交表来安排试验,适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等一类试验的设计。,在实验设计过程中只要根据试验条件直接套用正交表即可,而不需要另行编制。,三、实验动物的选择,目前国际常年保有的实验动物品种、品系达数百种，我国常年保有的实验动物品种、品系也有50余种以上。各实验动物品种的生物学特性差异较大，而同品种不同品系间也各有其具备优势的生物学特性。,怎样从广博的实验动物资源中选择合适的实验动物进行科学实验研究，是科研工作者在实验研究中首先碰到的问题。,在实验研究中，必须根据实验动物的特点，结合实验研究的目的，选择最适合该项实验目的的实验动物。 实验动物品种、品系选择正确与否，直接关系到研究结果的可信性、可靠性、可比性。,一、实验动物的选择原则,（一）相似性原则 （二）差异性原则 （三）易化原则 （四）相容或匹配性原则 （五）易获性原则 （六）重现性、均一性原则,（一）相似性原则 相似性原则是指利用动物与人类某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物。一般来说，动物所处的进化阶段越高，其功能、结构、反应也越接近人类，如猩猩、猕猴、狒狒等非人灵长类动物是最类似于人类的。,相似性可大致归纳为以下几方面： 1、结构与功能方面的相似性 哺乳动物中有许多解剖上的相似点，因而其生命功能基本过程也很相似。,2、时象或年龄状态的近似 不同种属实验动物的寿命长短不一，大多比人的寿命短，但在各相应生命阶段或时象上可相互对应。 在研究老年性或胚胎发育实验课题时，选择生殖和生命周期短的动物，无论从动物的来源或从实验周期的安排上都很容易做到。,犬与人的年龄对应,犬龄（年）1 3 5 9 13 16 人龄（年）15 28 36 52 68 80,3、群体分布的相似性 以群体为对象的研究课题，要选择群体基因型、表现型分布与人相似的实验动物。拟似自然群体基因型的实验动物群有封闭群或远交群动物。,4生态或健康状况的近似性 GF/GN、SPF、CL和CV级实验动物分别代表着不同的微生态模式，具有不同特点（参考微生物控制章节），适用于不同的研究目的。,如，SPF动物是正常的健康无病模型，采用该级别动物作实验，能排除疾病或病原体的背景性干扰；GF动物属超常生态模型，既能排除微生物的干扰，又减少了免疫功能的影响；,而CL及CV动物则应用很多，除有价廉和易获得外，对设施的要求较简便、管理也相对容易。但由于它们携带某些微生物，因而实验难于避免微生物的干扰。在选择时应结合课题目标、研究方法、设施条件及经费等作综合考虑。,5疾病特点的相似性 许多自发或诱发性疾病动物模型，能不同程度的反映与人类类似的疾病过程表现。这些疾病特点，有的经过各种遗传育种方法可在子代中稳定遗传，有的则可用各种手段在动物身上诱发复制。因而可根据实验目的，选用适当的疾病动物模型来进行实验研究。,6操作实感的相似性 为临床操作打基础的动物实验，如外科手术性的操作模型或教学示教，体型大的实验动物比体型小的在实感上更接近人类，对于培养操作技能和实做信心有好处。如模拟人类心脏移植，练习手术操作的动物实验，可选择猪做材料，因其心脏的形态大小与人很接近。,（二）差异性原则,各种实验动物在基因型、表现型、组织型、代谢型、易感性方面具有明显的不同，那么在实验因素的作用下，其反应有非常接近于人类的，也有比较接近于人类的，可能还会遇到与人类的反应截然相反的，不同种类实验动物对药物的不同反应以及不同种动物的基础代谢与人类的差异对实验产生较大的影响，这就要求我们不能忽略这些由于种属不同造成的反应差异性。,1、同一种药物使用在不同种类的实验动物身上，其反应既有共同性，又有特殊性。相对而言，在动物实验研究中研究不同种类的实验动物对同一药物反应的特殊性更有比较价值，因此，选择实验动物要根据被研究物质的理化特性和实验设计的要求，选择对该物质最为敏感实验动物。,苯让我的白细胞减少，造血器官发育不全,那，我和你一样接触苯，我怎么是白细胞增多，脾和淋巴结增生？,药物反应性,2、不同种属的实验动物的基础代谢率在实验设计和实验结果的比较讨论分析中起到非常重要的作用，一般说来，动物的体积越小，所需的单位体重的药物剂量越大。,常用的实验动物中，以小鼠的基础代谢率最高，鸽、大鼠、豚鼠、家兔、猫、鸡、犬、黑猩猩、山羊、绵羊、母猪、公猪、公牛次之，马和母牛最低，其中小鼠的单位体积所需的给药量是人类的10倍以上。,（三）易化原则,选择进化程度高或结构机能复杂的实验动物作模型，有时会使实验条件的控制和实验结果获得变得很困难。这种情况下，应遵从易化原则，在确保实现研究目标的前提下，选择那些结构、功能较简单的实验动物。,如人们利用果蝇寿命短（12d）、染色体少（4对）等特点，成功地进行了遗传学研究，并确定了染色体的连锁互换定律。同样方法若改用灵长目动物其难度是很难设想的。,蛙的大脑不发达，不可作为高级神经活动的实验，但蛙的脊髓具有最简单的发射中枢，做神经反射弧实验，简单、直观、明确、容易分析。,另外，有时为了避免系统背景作用而对某器官或某功能进行研究时，可用离体方法进行易化。 易化原则与“3R”原则相一致。,（四）相容或匹配性原则,所谓“相容”或“匹配”是指所用动物的标准化品质应与实验设计、技术条件、实验方法等条件相适应。要避免用高精仪器设备、试剂与低品质动物相匹配，或使用低性能测试手段与高品质动物相匹配。,做必要的预试验有助于选择与本课题相适应的实验动物 动物预试验的作用在于 1.初步观察动物是否适宜于本项目的研究 2.熟悉动物的生物学特性及饲养管理 3.检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步到位,（五）易获性原则,在选择实验动物时，既要注意选用与实验研究目的相符合的实验动物，又要注意在不影响实验质量的前提下，选用最易获得、最经济、最易饲养管理的实验动物来做实验研究，这样可以减少实验研究中的许多困难，大大增加实验研究的可行性和易行性。,（六）重现性、均一性原则,重现性和均一性是实验结果可靠、稳定的保证。为此，使用标准化实验动物是极其重要的。只有选用经遗传学、微生物学、环境及营养控制的标准化实验动物，才能排除微生物及潜在疾病对实验结果的影响，排除因遗传污染而造成的个体差异。,四、影响动物实验的个体因素,（一）年龄与体重 年龄是一个重要的生物量。实验动物的解剖生理特征和反应性随年龄而明显变化。在实验动物的发育上，有的以日计龄，有的以月计龄，有的以年计龄，也就是说，同日龄但不同种的动物之间其相对年龄可能大不相同。,注意各种实验动物之间、实验动物与人之间的年龄对应关系相当重要。 在研究目的人群中年龄分布和所选择的实验动物中年龄一定要相对应。,在实验动物年龄方面，毒理学研究要求一般选用未成年的较为合适。 因为在动物迅速生长时期进行药物的毒性试验，可以发现药物对生长及各器官，包括性器官成熟的影响。,药物长期毒性实验选用大鼠120150g（68周）； 农药慢性毒性实验选用大鼠6070g（46周）；,避孕药物的毒性实验要求使用性成熟动物，如小鼠应是至少60日龄、体重在24 g以上，大鼠至少120日龄、体重在250g以上。,实验动物的年龄与体重一般呈正相关，各品种或品系可根据其各自的年龄与体重正相关状况来推算其年龄。 同批实验的动物年龄应尽可能一致，体重应大致相近，一般相差不超过10%。,（二）性别 实验结果表明，性别不同的实验动物对同一药物的感受性有差异，对各种刺激的反应也不尽一致。,比如：大鼠皮下注射150300mg的乙醇溶液，雄性大鼠死亡84%左右，而雌性大鼠只死亡30%左右。,在一些麻醉药的使用上，性激素影响麻醉药的功效 。 麦角新碱对56周龄的雄性大鼠可见明显镇痛效果，如给雌性大鼠则没有镇痛效果。,雌性动物性周期不同阶段和怀孕、授乳时的机体反应性有较大改变，所以在科研实验研究中，如无特殊需要，一般优先选用雄性动物或雌雄各半做实验。 而不受性别影响的药物研究，可以雌雄不拘。,一般认为，动物对激素的依存性，是其药物毒性反应性别差异的主要原因。 药物反应有性别差异的例子很多,因此，在药品安全性评价研究中，通常选择实验动物应雌雄各半，因为雌雄动物间对药物中毒性物质的反应存在差异。,三）生理及功能状态 实验动物在处于特殊的生理状态如怀孕、哺乳时，其体重及某些生理生化指标将有所不同。如在妊娠期间，许多酶的活性降低，肝微粒体单胺氧化酶对某些外来物的代谢作用亦减弱 。,因此，一般实验研究不宜采用怀孕、哺乳的实验动物。但为了某种特定的实验目的，如为了阐明药物对妊娠及产前胎儿的影响时，就必须选用这类实验动物。妊娠和哺乳期大鼠和小鼠最适合进行这类实验。,实验动物由于所处的功能状态不同，对药物的反应也常常受到影响。如动物在体温升高的情况下对解热药比较敏感，而体温不高时则不敏感；血压高时对降压药比较敏感，而在血压正常时对降压药敏感性就差。,（四）健康状况 实验动物的健康状况对实验结果有直接的影响。一般情况下健康动物对药物和实验刺激的耐受力比有病的动物要大，实验结果稳定。,实验动物的潜在性感染也会对实验研究带来严重干扰。由于科研用大、小鼠我国已基本普及清洁级或SPF级，其健康状况较好。但大动物如家兔、犬、豚鼠等在现阶段仍大部分使用普通级，由于客观环境因素、微生物因素的影响，在使用前应对实验需用的每只动物仔细的健康检查。,为保险起见，可根据具体情况相应多购入部分动物，做好实验前检疫。实验前通常要观察714天，除一般表现如摄食量与活动度及两便外，应每隔12天称体重和测体温。发现不健康动物应予以剔除。,对于犬、猫、猴等大动物的检疫，有时需要检查实验分组前实验动物的血常规、血清生化指标（谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌肝）外加实验动物的二导心电图。,五、实验技术环节对动物实验效果的影响,1、药物因素 （一）抗菌素 （二）麻醉剂和镇静剂 （三）赋形剂 （四）实验药物,2、实验季节 生物体的许多功能随着季节产生规律性的变动。 动物对化学物作用的反应也受到季节的影响。 因此，季节的波动在进行跨季度的慢性实验时是必须注意的。,3、给药时间与试验周期 动物的各项生命活动都具有一定的周期性，每天的不同时间，每年的不同季节都有一定的变化规律，生命节律是生命的基本特征之一 。,一般来讲，对那些在体内代谢特别快的药，可以考虑增加给药频率；