基因工程制药-苏州培训20170520.ppt

基因工程制药简介,张义浜 2017-05-20,概述 目的基因的获得 基因的表达 基因工程菌的培养 基因工程药物的分离纯化,传统制药（生化制药）存在的问题: 1.材料来源或制造技术困难而无法研制出产品； 2.从动物脏器中提取易感染病毒； 3.存在免疫原性，使用受限制。,基因工程制药的优点,大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽 提供足够数量的生理活性物质 发现更多的内源性生理活性物质 利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值 获得新型化合物，扩大药物筛选来源,基因工程技术所生产的药物,用传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质/多肽，包括： （1）免疫相关蛋白-各种抗原、单克隆抗体。 （2）细胞因子-如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO （3）激素-胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。 （4）酶类-尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。,早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间,我国批准上市的部分生物技术药物,什么是基因工程技术？ 基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。,制备基因工程药物的基本过程,获得目的基因 构建重组质粒 组建基因工程菌 (或细胞) 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装,选择表达系统主要考虑： 必须保证所表达的蛋白质具有生物活性 考虑基因工程蛋白质表达量的多少 蛋白质分离纯化的难易程度,基因的克隆,目的基因的获得,一、反转录法 二、反转录PCR 三、化学合成法,常用的方法:,一、反转录法 为了克隆编码某种特异蛋白质 多肽的DNA序列，可以从产生该蛋 白质的真核细胞中提取mRNA, 以 其为模板，在反转录酶的作用下， 反转录生成该蛋白质mRNA互补 DNA（cDNA第一链），再以cDNA 第一链为模板，在DNA聚合酶作 用下，最终合成编码该多肽的双链 DNA序列。,二、反转录PCR 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模 板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA 第一链，直接以其为模板（不需要合成cDNA第二链）进行PCR扩增，获得目的基因，用于重组、克隆。,三、化学合成法 前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白质的氨基酸序列，再推导出核苷酸序列 限制性： 1）不能直接合成太长的基因； 2）遗传密码的简并性可导致中性突变； 3）成本较高,DNA合成仪,基因的克隆与表达,基因表达：基因在生物体中的转录、翻译及所有加工过程。 基因高效表达：外源基因在某种宿主细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，重组到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 基因表达研究的主要问题：目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。 建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键,一、宿主菌的选择 宿主菌应满足以下要求： 具有高浓度、高产量、高产率； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 方便重组DNA操作； 产物容易提取纯化。,1.原核细胞 （1）大肠杆菌 表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包涵体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。不同的表达形式具有不同的表达水平及完全不同的杂质。,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，遗传背景清楚（共4405 ORF） 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,缺陷,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,（2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包涵体；不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解,（3）链霉菌 重要的工业微生物。不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有一定的糖基化能力,2、真核细胞 （1）酵母 特点： 真核生物细胞，表达产物能糖基化； 基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； 世代时间短，繁殖迅速； 基因操作与原核生物相似； 建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。,（2）丝状真菌 特点： 有很强的蛋白分泌能力； 能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等; 其糖基化方式与高等真核生物相似； 丝状真菌（如曲霉等）等被确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。,真核生物和原核生物基因表达过程示意图,克隆载体: 克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 表达载体: 将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 插入型载体: 将外源基因或DNA插入其中 置换型载体: 切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。,载体（vector）,质粒（plasmid）,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。,原核细胞表达载体,非融合型pKK223-3 分泌型PIN-ompA1,融合蛋白表达载体pGEX结构,包涵体型pBV220结构,融合蛋白表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 包涵体型表达载体,（一）表达载体 表达载体必须具备的条件： 载体能够独立的复制； 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记, 且克隆位点应在启动子序列后，以便外源基因表达； 具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录； 具有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因； 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。,（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的剂量 外源基因的表达效率： A、启动子的强弱：将目的基因插入大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子下游 B、核糖体结合位点的有效性 C、SD序列和起始密码的间距 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子,表达产物的稳定性： A、组建融合蛋白； B、利用信号肽将真核基因产物搬至周质空隙中； C、位点特异性突变，增加蛋白的稳定性； D、采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，减弱降解作用 细胞的代谢负荷： A、宿主细胞的生长与外源基因的表达分开； B、宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开； C、形成不溶性的包涵体 工程菌的培养条件,（三）真核基因在大肠杆菌中表达的形式 1.以融合蛋白的形式表达药物基因 其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白结合在一起，称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，不易被 细菌酶类降解；易实现高效表达； 缺点：有免疫原性，需切除原核多肽,2.以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏；可能引起人体免疫反应,3.分泌型表达蛋白药物基因 将外源基因融合到编码信号肽序列的下游。 常用的信号肽有：碱性磷酸酶信号肽；膜外周质蛋白 信号肽；霍乱弧菌毒素B亚单位； 优点：在周质中稳定，有活性，不含甲硫氨酸残基； 缺点：产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。,酵母中的基因表达 （一）表达载体 1.载体的复制序列 （1）YEp类（酵母附加体质粒） （2）YRp类（酵母复制型质粒） （3）YCp类（酵母着丝粒质粒） （4）YIp类（酵母整合型质粒）,2. 克隆载体 向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部 分和Ampr或Tetr部分，这样构成的克隆载体同时带 有细菌和酵母的复制原点和选择标记。 酵母常用的选择性标记：氨基酸或核苷酸合成酶 系基因，对抑制酵母生长的药物具有抵抗力的抗性 基因,3.表达载体 普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行表 达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸 是否增减并无严格要求。 精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的 适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并 使它在表达和加工后N末端氨基酸序列与天然产物 相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。,（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1.外源基因的剂量：质粒拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性 2.外源基因的表达效率： A、启动子 B、分泌信号的效率 C、终止序列的影响,3.外源蛋白的糖基化 4.宿主菌株的影响： A、菌体生长力强； B、菌体内源蛋白酶要弱； C、菌株性能稳定； D、分泌能力强,基因工程菌的培养,基因工程菌发酵的基本操作方式有： 分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物 连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。 透析培养 固定化培养,基因工程菌培养方式,补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。,连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。 但由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。,透析培养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响,固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。,基因工程菌发酵中试,基因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法的选择，分离精制技术的选择。,基因工程菌的不稳定性,主要表现在重组质粒的不稳定性， 两种表现形式： 1）结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失 2）分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸,基因工程菌不稳定性的可能产生机制：,受体细胞中限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,培养基 比生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达,遗传特性,影响基因工程菌稳定性的因素,载体的选择 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上,发酵工艺,1.培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较基本培养基快。,培养条件对基因工程菌稳定性的影响,2.比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。,3.限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响,4. pH 和溶解氧 pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。,5.外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定；尤其当外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp 的比例上升。电泳分析表明 60%70% 色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。,1、改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 1）将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2）正确设置载体上的多克隆位点，禁止 DNA 片段插在稳定区内 3）将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因（ DNA 单链结合蛋白编码基因）,提高基因工程菌稳定性的策略,2、施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素；加入大量的抗生素会使生产成本增加；添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间；添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高,提高基因工程菌稳定性的策略,3、分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。,提高基因工程菌稳定性的策略,4、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 5、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,提高基因工程菌稳定性的策略,6、控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。 例如研究表达干扰素的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大.,提高基因工程菌稳定性的策略,7、固定化培养 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。 在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。,提高基因工程菌稳定性的策略,基因工程药物的分离纯化,目的产物在初始物料中的含量较低； 含目的产物的初始物料组成复杂，除目的产物外，还有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大； 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性； 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构和性质复杂又各异的生物活性物质； 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原。,基因工程药物或生物技术产品特点,一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 1. 含目的产物的初始物料的特点 （1）菌种类型及其代谢特性 （2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定 （3）生产工艺和条件 （4）初始物料的物理、化学和生物学特性 2. 物料中杂质的种类和性质 3. 目的产物特性 4. 产品质量的要求,二、分离纯化的基本过程 基因工程药物的分离纯化主要分为5个步骤， 包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度 纯化直至得到纯品，以及成品加工。,分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。 色谱技术分为： 离子交换色谱 亲和色谱 凝胶过滤色谱 高效液相色谱等,三、重组蛋白质的分离纯化,产物的主要特性及在分离纯化中的作用,基因工程药物生产中常用的分离纯化方法,基因工程药物制造实例,干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。 干扰素在我国已经批准上市的基因工程药物。 早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg,（一）干扰素,2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。,诱生的白细胞或者成纤维细胞提取核酸 通过寡dT-纤维素柱提取mRNA pBR322质粒 5%-23%蔗糖密度梯度离心提取12S- mRNA 内切酶切割 由mRNA转录成cDNA 切割段位于内酰胺基酶基因内 结果导致内酰胺基酶失活，不抗青霉素 双链cDNA用末端Pst-I酶切割 再用DNA转移酶接上dT或者dG 在pBR322质粒DNA的切割段加上dA或者dC + 退火获得杂交质粒 转化大肠杆菌K-12扩增杂交质粒 筛选能够抗四环素、但是对氨苄青霉素敏感的细菌克隆株 采用杂交翻译法挑选含有干扰素cDNA的克隆 将干扰素cDNA克隆进表达载体 在大肠杆菌中进行高效表达 （进入下游工艺）,工程菌构建,工程菌的发酵生产,人干扰素a-2b的基因工程菌为SW-IFNa-2b/E.coliDH5a。 质粒使用PL启动子，含有氨苄青霉素抗性基因。 种子培养液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。 基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶之中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30摇床培养10小时，作为发酵罐的种子。 用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L 发酵培养基组成如下（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml氨苄青霉素、少量防泡沫剂。pH=6.8。） 搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50% 30发酵8小时（细菌增殖阶段） 42诱导2-3小时（产物生产阶段） 监控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。,发酵物质4000r/min离心30min，除去上清液。得湿菌，从其中取100g。悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.0）500ml之中，冰浴条件下进行超声破碎。 4000r/min离心30min，除去上清液。沉淀