microRNA检测技术在临床的应用.ppt

第一节 概述,一、 miRNA概念与特点 (一) miRNA概念 miRNA是一类进化上保守的单链非编码小分子RNA，定位于RNA前体的3端或5端，具有在翻译水平调控基因表达的功能。,上一页,下一页,返回,第一节 概述,一、 miRNA概念与特点 （二）miRNA基本特征 1.结构特征 2. miRNA的存在形式 3. 保守性 4.时空特异性,上一页,下一页,返回,第一节 概述,一、 miRNA概念与特点 （三）不同生物的miRNA特点 植物与动物miRNA的区别,上一页,下一页,返回,第一节 概述,一、 miRNA概念与特点 （四）miRNA与siRNA的比较 1.miRNA与siRNA相同之处 （1）二者的长度都约在22nt左右。 （2）二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点: 5端磷酸，3端均有2个游离核苷酸。 （3）miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。 （4）二者都是RNA诱导的基因沉默复合体 (RNA induced silencing complex，RISC)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。,上一页,下一页,返回,第一节 概述,一、 miRNA概念与特点 （四）miRNA与siRNA的比较 2.miRNA和siRNA区别： （1）根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，。 （2）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。 （3）本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。 （4）在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。 （5）miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。,上一页,下一页,返回,第一节 概述,二、miRNA生物合成与功能 （一）miRNA生物合成,上一页,下一页,1 miRNA生物合成过程 在细胞核内，基因组DNA 转录生成较长的RNA分子（可长达1000nt），被双链RNA 特异的核糖核酸酶 Drosha 切割成长度大约70-100 碱基的、具发夹结构的RNA 分子（前体 microRNA）。这些发夹结构的RNA 通过核输出蛋白exportin5 机制转运到细胞质，然后被第二个双链 RNA 特异的核糖核酸酶Dicer 切割，得到19-23nt 大小的成熟的miRNAs 产物。,返回,第一节 概述,二、miRNA生物合成与功能 （一）miRNA生物合成,上一页,下一页,miRNA生物合成过程,返回,第一节 概述,二、miRNA生物合成与功能 （一）miRNA生物合成,上一页,下一页,2 miRNA在基因组分布,独立表达的miRNAs 成簇表达的miRNAs 位于内含子的miRNAs,返回,第一节 概述,二、miRNA生物合成与功能 （二）miRNA 生物学功能 1.miRNA调控基因表达机制,上一页,下一页,miRNA调控基因表达两种机制,miRNA调控蛋白翻译,miRNA调控mRNA降解,返回,第一节 概述,二、miRNA生物合成与功能 （二）miRNA 生物学功能 2 .miRNA调控基因表达的特征与优点 （1） miRNA调控基因表达的特点 1）交叉调节 ; 2）自我调节; 3）可逆性调节. （2） miRNA调控基因表达的优点 1）与蛋白水平的调节相比，更加节省能量 2） 与转录水平调节相比， miRNA 调节更迅速，而且是可逆的 3）内含子所编码的 miRNA 是一种对基因组资源的高效利用,上一页,下一页,返回,第一节 概述,三miRNA应用 （一）基因功能的分析 （二） miRNA 功能和效应的评价 （三） 新型基因治疗方案的设计和发展 （四）抗病毒疫苗的设计和研制 （五）功能缺失转基因动物的建立,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,一、理想的miRNA检测与定量方法miRNA检测 1.具有足够的灵敏性检测到少量的miRNA； 2.具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的 miRNA； 3.能够进行miRNA表达的定量分析； 4.进行多样本平行检测；检测过程简便、经济。,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （一）基因芯片技术 miRNA microarray可以检测组织特异的miRNA,并且实验结果可重复率高。这种微芯片不仅可以检测miRNA的类型,还可以对其进行定量。它可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达;通过设计适当的寡核苷酸探针,同时检测成熟的miRNA及其前体分子; miRNA microarray可以用于高通量的筛选miRNA,并且可以用于临床病例的筛选。,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （一）基因芯片技术,上一页,下一页,基因芯片技术检测 miRNA表达的基本原理,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （二）荧光定量技术 实时定量逆转录PCR可用于检测miRNA的表达水平。 Step-loop实时定量是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（stem loop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 2个关键步骤。该技术有以下优点：高度特异性，特异的step-loop 反转录引物和探针确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,Step-loop 反转录PCR检测miRNA基本原理,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （三）克隆测序技术 大多数现有的miRNA是通过cDNA克隆识别和鉴定出来的,这是发现miRNA的重要方法。构建miRNA的cDNA文库通常有两种方法, 一种是将所有的RNA通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离回收25nt以下的小片段RNA, 随后在RNA3和5端连上接头,逆转录后与对应引物进行PCR扩增, 再将片段克隆至载体,最后对每个克隆进行测序。 第二种方法是分离出小片段RNA后,用poly(A)聚合酶在3端进行多聚腺苷酸化反应, 逆转录后, 再在cDNA3端进行鸟苷酸化反应, 随后进行扩增和测序, 最后通过PAGE/Northern blot等予以验证。,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,上一页,下一页,克隆测序技术进行miRNA检测的基本原理,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （四）原位杂交技术 原位杂交( In situ hybridization ) 检测miRNAs逐渐发展起来,它可以检测候选miRNAs的短暂表达 。应用原位杂交技术可进行石蜡包埋、福尔马林固定的组织内的miRNA检测，同时可以不再分离miRNA情况下，进行多细胞之间miRNA表达的检测 。,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,上一页,下一页,原位杂交方法检测miRNA的基本原理,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,二、几种常用miRNA检测与定量的方法 （五）Northern杂交技术 RNA印迹即Northern blot是最经典的检测真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本中同时获得这些信息, 主要包括: 完整的RNA的分离; 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离; 将RNA转移到固相支持物上,在转移过程中,要保持RNA在凝胶中的相对分布; 将RNA固定到固体支持物上; 固相RNA与探针分子杂交;除去非特异结合到固相支持物上的探针分子; 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。,上一页,下一页,返回,第二节 miRNA检测与定量方法,上一页,下一页,Northern杂交技术进行miRNA检测的基本原理图,返回,第三节 miRNA检测的临床应用,上一页,下一页,一 、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用 最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“ONCOMIRs”。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。,返回,第三节 miRNA检测的临床应用,上一页,下一页,一 、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用 （一）microRNA与癌症产生,MicroRNAs诱发肿瘤的机制,返回,第三节 miRNA检测的临床应用,上一页,下一页,一 、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用 （二）oncoMIR的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发