GBT27820-2011化学品体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验方法.pdf

I C S1 3 3 0 0 ；1 1 1 0 0 A8 0 圆雪 中华人民共和国国家标准 G B T2 7 8 2 0 - - 2 0 I1 化学品体外哺乳动物细胞姊妹染色 单体交换试验方法 C h e m i c a l s - - T e s tm e t h o do fi nv i t r om a m m a l i a nc e l l ss i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g e 2 0 1 l - l l - 3 0 发布2 0 1 2 - 0 8 - 0 1 实施 宰瞀髅紫瓣訾瓣瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪1 9 前言G B T2 7 8 2 0 2 01 1本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准与联合国经济合作与发展组织( O E C D ) 化学品测试指南N o 4 7 9 ( 1 9 8 6 ) ( 体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验( 英文版) 技术性内容一致。本标准做了下列结构和编辑性修改：增加了范围一章；将O E C D 4 7 9 原文中的“简介”部分内容作为本标准的“引言”；将O E C D 4 7 9 原文中的“必备资料”部分内容，作为本标准“4 1 1 ”；计量单位统一改为我国法定计量单位。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会( s A c T c2 5 1 ) 提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工经济技术发展中心、江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曲波、林铮、李雪飞、白羽、杨挺、汤礼军。 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 7 8 2 0 - - 2 01 1引言体外姐妹染色单体交换( S C E ) 试验是一项快速检测复制期染色体两条姐妹染色单体问D N A 相互交换的试验，S C E 代表姐妹染色单体同源位点上D N A 复制产物的相互交换。尽管其分子机制还不清楚，但推测其交换过程可能包括D N A 断裂和重连两个步骤。检测S C E s 需要使用某种方法对不同的染色体进行标记。如可采用在染色体D N A 中掺入溴代脱氧尿嘧啶( b r o m o d e o x y u r i d i n e ，B r d u ) 并复制两个细胞周期的方法。S C E s 可以在哺乳动物或非哺乳动物系统中进行。 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 1 范围化学品体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验方法G B T2 7 8 2 0 - - 2 011本标准规定了化学品体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于化学品体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2 1姊妹染色单体交换s i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g e ，S C E细胞分裂复制期单个染色体内的两个染色体单体的相互交换。在细胞分裂中期相可见到这种交换，它可能需要D N A 双螺旋的酶切、转移和连接。3 试验原则哺乳动物细胞在加入和不加入外源性代谢活化系统条件下，在含有受试物和溴代脱氧尿嘧啶( b r o m o d e o x y u r i d i n e ，B r d U ) 的培养液中，连续培养两个细胞周期。加入纺锤体抑制剂( 如秋水仙素) ，将分裂的细胞汇聚停留在中期分裂相样阶段，收获细胞、制备染色体。4 试验方法4 1 准备4 1 1 受试物应提供受试物的物态、纯度、溶解性、熔点沸点、p H 值( 如果适用) 、蒸气压( 如果有) 等资料。应在细胞染毒前准备好含有受试物的培养基或将受试物溶解在合适的介质中，受试物应新鲜配制。介质的终浓度不能显著影响细胞活性、生长率和S C E 频率。4 1 2 细胞和培养方法可使用原代培养细胞( 如人淋巴细胞) 或已建立的细胞系( 如中国仓鼠卵巢细胞或肺细胞) 。细胞系应保证无支原体污染和核型稳定。采用合适的培养基和培养条件( 如温度、培养皿、C O 。浓度和湿度) 。4 1 3 代谢活化分别在有无合适的哺乳动物代谢活化系统条件下用受试物对细胞染毒。常用的代谢活化系统有酶诱导剂诱导过哺乳动物肝匀浆微粒体酶系统并加入辅助因子配制成的活化系统，以及原代培养的哺1 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 7 8 2 0 2 0 1 1乳动物肝细胞。4 2 试验条件4 2 1 染毒浓度至少使用三个剂量差别足够大的受试物浓度。最高浓度应能引起明显的毒性效应，但应同时保证有足够多的细胞进行复制。对于相对不溶于水的受试物，应选择合适的方法提高溶解性，使用其最大浓度试验；对于溶于水且无细胞毒性的受试物，其最高浓度依情况而定。4 2 2 培养数量每个试验点至少有双份平行操作的培养标本。4 2 3 对照组每一剂量组均应设有直接断裂剂和间接断裂剂的阳性对照。还应设溶剂对照。阳性对照物可以选择以下物质：甲磺酸乙酯( e t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t e ，E M S ) 、丝裂霉素C ( m i t o m y c i nc ) ( 直接断裂剂) ；环磷酰胺( e y c l o p h o s p h a m i d e ) ( 间接断裂剂) 。4 3 操作方法4 3 1 试验细胞培养准备对于建系的细胞可以从培养好的细胞中获得( 通过胰酶消化或吹打) ，按适宜的密度接种于培养皿中，3 7 培养。对于单层培养细胞，接种的密度应使细胞在收获时不出现融合。也可以使用悬浮培养细胞，如从人血液中分离的淋巴细胞，经合适的处理后，于3 7 培养。4 3 2 染毒应在细胞指数增长期给予细胞受试物染毒。作用时问1h 2h ，但有时可能要延长到两个完整的细胞周期。在某些情况下，在无血清的培养基中染毒更有效。细胞应分别在加入代谢活化系统和不加入代谢活化系统的条件下染毒。染毒结束时，洗脱受试物，在新培养基中加入B r d U ，继续培养两个细胞复制周期。也可选择在同时含有受试物和B r d U 的培养基中培养细胞两个完整的细胞周期。人血淋巴细胞应当在细胞处于半同步状态下染毒。应在染毒开始后细胞的第二个有丝分裂期分析，以保证细胞在最敏感细胞周期内接触到受试物。所有加入B r d U 的培养皿在细胞收获前应尽量减少光照，以降低掺人B r d U 的脱氧核糖核酸( D N A ) 光解。4 3 3 收获细胞在收获细胞前1h 4h ，用纺锤体抑制剂( 如秋水仙碱) 处理细胞，分别收获和处理各剂量组细胞、制备染色体。4 3 4 染色体制备和染色用标准细胞遗传学技术方法制备染色体标本，可采用几种技术染色显示S C E s ，如荧光加吉姆萨法染色。4 3 5 染色体分析一般每个培养皿至少分析2 5 个染色体分散良好的中期分裂相细胞，但分析细胞的数量也可根据对2 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 7 8 2 0 - - 2 01 1照组自发交换频率的情况而变化。玻片在分析前应编号。人血淋巴细胞，只分析含4 6 个着丝粒的中期分裂相细胞；对于建系的细胞系，仅分析含有2 条着丝粒的中期分裂相细胞。无论交换是否带着丝粒均记为一次S C E 。试验的结果需要独立的试验验证。5 试验数据和报告5 1 数据处理结果以表格形式表示。应列出染毒组和对照组每个中期分裂相细胞的S C E s 数、染色体数和每条染色体S C E s 平均数。使用合适的统计学方法统计处理。5 2 结果评价阳性结果的判断标准：每个中期分裂相细胞S C E s 平均数随着染毒剂量增高而显著增加；或是至少在一个检测点S C E s 有可重复的、有统计学意义的增高。阴性结果的判断标准：单个细胞S C E s 平均数与染毒浓度问未观察到有统计学意义的相关关系，也不存在在某个检测点出现S C E s 有可重复的、有统计学意义的增高。5 3 试验报告试验报告应包括以下内容：使用的细胞、细胞培养方法；测试条件，包括培养基成分、C O 。浓度、受试物浓度、溶剂、培养温度、染毒时间、纺锤体抑制剂、纺锤体抑制剂浓度和作用时间、使用的哺乳动物代谢活化系统类型、阳性和阴性对照、B r d U 浓度；每个试验点培养细胞的数量；玻片制备的详细技术描述；列出分析的中期相细胞数( 每个培养皿) ；列出每个细胞和染色体S C E s 平均数( 每个培养皿) ；s c E s 计数的标准；染毒浓度设置的原则；剂量一反应关系( 如可能) 统计学评价；结果的讨论；结果的解释。 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 7 8 2 0 - - 2 0 1 1 参考文献 E l iS A L a t t ，J W A l l e n ，S E B l o o m ，A C a r r a n o ，E F a l k e ，D K r a m ，E S c h n e i d e r ，R S c h r e c k ， R T i c e ，B W h i t f i e l da n dS W o l f f ，S i s t e rC h r o m a t i dE x c h a n g e s ，i nR e p o r to ft h eG e n e - T O XP r o g r a m 。 M u t a t i o n R e 5 1 9 8 1 ：8 7 ：1 7 6 2 E 2 P P e r r y ，L H e n d e r s o na n dD K i r k l a n d ，S i s t e rC h r o m a t i dE x c h a n g ei nC u l t u r e dC e l l s ，i n R e p o r to ft h eU K E M S S u b c o m m i t t e eo nG u i d e l i n e sf o rM u t a g e n i c i t yT e s t i n g ，P a r t ，1 9 8 4 ：8 9 1 2 2 3 P E P e r r ya n dE J T h o m s o n ，T h eM e t h o d o l o g yo fS i s t e rC h r o m a t i dE x c h a n g e ，i nH a n d b o o k o f M u t a g e n i c i t yT e s tP r o c e d u r e s ，2 n dE d i t i o n ( e d i t e db yB J K i l b e y ，M L e g a t o r ，W N i c h o l s a n d C R a m e l ) ，E l s e v i e rS c i e n t i f i c ，A m s t e r d a m ，1 9 8 4 ：4 9 5 5 3 0 4 P E P e r r y ，C h e m i c a lM u t a g e n sa n dS i s t e rC h r o m a t i dE x c h a n g e ，i nC h e m i c a lM u t a g e n s ， V 0 1 6 ( e d i t e db yF J d eS e r r e sa n d A H o l l a e n d e r ) ，P l e n u mP u b l i s h i n gC o ，N e w Y o r k ，1 9 8 0 ：1 - 3