GBT18634-2002饲用植酸酶活性的测定分光光度法.pdf

G B / T 1 8 6 3 4 -2 0 0 2 前言 本标准参考美国公职分析化学家协会( A O A C ) 方法和国外有关文献资料制定。 本标准确定了饲用植酸酶的活性单位定义， 采用钒铝显色分光光度法测定植酸酶活性。 此项标准分 为绝对法和相对法， 对标准物质和试剂的选择均有详细说明。 规定了方法的适用范围. 检测原理， 检测程 序及最佳样品浓度。 本标准的附录A是提示的附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位: 国家饲料质量监督检验中心( 北京) 、 罗氏泰山( _ L 海) 维生素制品有限公司、 巴斯 夫维生素有限公司。 本标准主要起草人: 马东霞、 苏晓鸥、 张苏、 王云全、 张若寒。 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法 D e t e r mi n a t i o n o f f e e d p h y t a s e a c t i v i t y S p e c t r o t h o t o m e t r i c me t h o d G B / T 1 8 6 3 4 一 2 0 0 2 飞 范围 本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。 本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品， 也适用于添加有植酸酶的配合饲料、 浓缩饲料和添加 剂预混合饲料。 样品最低检出 量为9 0 U / k g , 2 引用标准 下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均 为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 6 6 8 2 - - 1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法( n e q I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) 3 植酸酶活性单位定义 样品在植酸钠浓度为 5 . 0 m mo l / L, 温度 3 7 C, p H值 5 . 5 0的条件下， 每分钟从植酸钠中释放 1 ti m o l 无机磷， 即为一个植酸酶活性单位， 以U表示。 4 方法原理 植酸酶在一定温度和p H条件下， 水解底物植酸钠， 生成正磷酸和肌醇衍生物， 在酸性溶液中， 用钒 钥酸钱处理会生成黄色的 ( N H , ) , P O , N H , V O , “ 1 6 Mo O , 复合物， 在波长4 1 5 n m下进行比色测定。 5 试荆和溶液 本标准中所用试剂， 在没有注明其他要求时， 均指分析纯试剂和符合G B / T 6 6 8 2 中规定的三级水。 清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。 5 . 1 乙酸缓冲液( I ) , c ( C H , 0 0 0 N a 3 H , O ) 为0 . 2 5 m o l / I : 称取3 4 . 0 2 g 三水乙酸钠， 0 . 1 g 吐温2 0 于 1 0 0 0 m 工容量瓶中， 加人 9 0 0 m L水溶解， 用盐酸调节 p H至 5 . 5 0 士0 . 0 1 ， 并用蒸馏水定容至 1 0 0 0 M L , 室温下存放2 个月有效。 5 . 2 乙酸缓冲液( I ) , c ( C H 3 0 0 0 N a “ 3 H , 0 ) 为0 . 2 5 m o l / I : 称取3 4 . 0 2 g 三水乙酸钠， 5 g 吐温2 0 , 3 0 g乙二胺四乙酸二钠( E D T A ) 于1 0 0 0 M I容量瓶中， 加人9 0 0 m 工 _ 水溶解， 用盐酸调节p H至5 . 5 0 士 0 . 0 1 ， 并用蒸馏水定容至 1 0 0 0 m L , 室温下存放2 个月有效。 5 . 3 植酸钠溶液， c ( C 6 H ) , P , N a) 为 7 . 5 m m o l / 1 _ : 称取 0 . 6 9 2 9 g肌醇六磷酸钠( C , H , O , , P , N a : ) 于 1 0 0 m 工容量瓶中， 用乙酸缓冲液( 5 . 1 ) 溶解并定容至刻度， 现用现配( 实际反应液中的最终浓度为 5 . 0 mmo l / I ) 。 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 2 - 0 2 - 1 9 批准2 0 0 2 - 0 7 - 0 1 实施 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G s / T 1 8 6 3 4 一 2 0 0 2 5 . 4 硝酸溶液: 1 +2 水溶液。 5 . 5 1 0 0 g / 1铝酸按溶液: 称取l o g 钥酸t L ( N H , ) 6 M o , 0 2 4 . 4 H 2 0 习 于1 0 0 m 工容量瓶中， 加人l . 0 m l , 氨水( 2 5 0 o ) 用水溶解定容至刻度 5 6 2 . 3 5 g / 1 钒酸钱溶液: 称取0 . 2 3 5 g 钒酸钱( N H 4 V O 3 ) 于1 0 0 m 工 ， 棕色容量瓶中， 加人Z m 工 J 硝酸 溶液( 5 . 4 ) ， 用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。 5 . 7 颜色终止液: 移取2 份硝酸溶液( 5 . 4 ) , 1 份钥酸钱溶液( 5 . 5 ) , 1 份钒酸钱溶液( 5 - 6 ) 混合后使用， 现用现配。 5 . 8 植酸酶标准品( 标明准确活性单位和类型) 。 5 . 9 磷酸二氢钾( K H , P O) : 基准物。 6 仪器和设备 6 . 1 实验室常用仪器设备。 6 . 2 恒温水浴 ( 3 7 士。 . 1 ) c . 6 . 3 分光光度计: 有 1 0 m m比色皿， 可在 4 1 5 n m下测定吸光度。 6 . 4 磁力搅拌器。 6 . 5 涡流式混合器。 6 . 6 酸度计: 精确至小数点后2 位。 6 . 7 离心机: 转速为4 0 0 0 r / m i n以上。 了 试样制备 取有代表性样品， 用四分法将试样缩分至2 。 。 9 ， 植酸酶产品不需粉碎， 配合饲料和添加剂预混合饲 料需粉碎通过0 . 4 5 m m标准筛， 装人密封容器， 防止试样成分变化。 8 测定步骤 8 - 1 绝对法( 仲裁法) 8 . 1 . 1 标准曲线 准确称取。 . 6 8 0 4 g 在1 0 5 c 烘至 恒重的基准磷酸二氢钾( 5 . 9 ) 于1 0 0 m L容量瓶中， 用乙酸缓冲液 ( 5 . 1 ) 溶解， 并定容至1 0 0 m L ， 浓度为5 0 . 0 m m o l / L 。 按表1 的比例稀释成不同浓度， 与试样一起反应测 定， 以无机磷浓度为横坐标， 吸光值为纵坐标， 列出直线回归方程( y =a z +b ) 表 l 标准序号稀释量/ .L浓度八m m o l / L ) 1 2 3 4 5 0 . 5 1 0 . 5 - 2 0 . 5 - 4 0 . 5 - 8 0 . 5-1 6 2 5 1 2 5 6 . 2 5 3 . 1 2 5 1 . 5 6 2 5 8 门. 2 试样溶液的制备 按照附录八中建议的称样量称取试样两份， 精确至0 . 0 0 0 1 g . 置于 1 0 0 m L容量瓶中， 加人约 7 0 ml 乙酸缓冲液( 5 . 1 ) “ ， 一个磁力棒， 在磁力搅拌器( 6 . 4 ) 上高速搅拌 3 0 m i n ， 用乙酸缓冲液( 5 . 1 ) 定 容至刻度( 减去磁力棒的体积) 。 摇匀， 在离心机( 6 . 7 ) 上以4 0 0 0 r / m i n离心1 0 mi n 。 分取不同体积的上 清液用乙酸缓冲液( 5 . 1 ) 稀释， 使样液浓度保持在 。 . 4 U/ mI左右， 待反应 飞 ) 添加剂预溉合饲料样品需采用乙酸缓冲液( 5 . 2 ) 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 8 6 3 d 一 2 0 0 2 建议在测定样品时附加一个己知活性的植酸酶参考样， 便于检验整个操作过程是否有偏差。 8 门. 3 反应 取 10 ml _ 试管按下面的反应顺序进行操作， 在反应过程中， 从加入底物( 5 . 3 ) 开始， 向每支试管中 加人试剂的时间间隔要绝对一致， 37 水解30 m in。 反应步骤及试剂、 溶液用量见表 2 表 2 反应顺序 样品 、 标准样品空白( 标准空白) 1 . 加乙酸缓冲液( 弓 . 1 或 5 . 2) 1 . sml _ 1 . sml( 2 0ml) 2 . 加人待反应液 0 . 2ml _ Mm L_ 3 .混合 甲丫 4 .3 7 (预热 s min 丫 5 依次加人底物(5. 3) 4ml 4 rnL ( 第二步) 6 .字 昆 合 丫 丫 7 . 3 7 水解 3() mln 丫 8 . 依次加人终止液( 5 . 7 ) 4ml 一一一 4 rn l ( 第一步) 9 .混合 寸丫 .急体积 飞 Oml I Ornl _ 8 . 1 . 4 样品测定 反应后的试样在室温下静置10min ， 如出现混浊需在离心机( 6 . 7)上以4 o 00r/m in离心10m m， 上清液以标准曲线的空白调零， 在分光光度计(6. 3 ) 415n m波长处测定样品空白( A 。 ) 和样品溶液( A) 的吸光值， 八一A 。 为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性 8 . 2 相对法 8 . 2 门标准曲线 准确称取一定量的标准植酸酶(5. 8)， 精确至。 . 0 00 1 9 ， 于50m l容量瓶中， 用0 2 5 m ol / L乙酸缓 冲液( 易 . 1)溶解并定容至刻度。做两次稀释使植酸酶活性大约在。 . 05 U/ m 工左右， 当日 配制。 将上述植酸酶标准液再按表3比例用缓冲液(5. 1)进行稀释， 需要准确计算植酸酶的浓度。然后与 样品一起进行反应测定。以植酸酶浓度为横坐标， 吸光值为纵坐标， 列出直线回归方程( y = a 二 斗b ) 。 表 3 叮 一 一 一 一 飞蒲藻 厂一一 一丁一一不巍藕 翻 寇 丽 云大 约 酶 活 性 八 u/ m L ) 0 5 0 1 0 5 . 0 1 . 5 于 5 . 0 2 . 0 一 5 . 0 2 5 5 0 3 . 0，5 . 0 3 . 5下5 . 0 0. 01 0 01502C025 : . : : : 8 ， 2 . 2 样品溶液的制备 以下操作步骤按8 . 1 . 2 进行， 使样液浓度保持在0 . 02 U/ ml左右。待反应 注: 添加剂预混合饲料样品需采用乙酸缓冲液(5. 2) 8 . 2 . 3 ) 乏 应 取 1 o1们 试管按下面的反应顺序进行操作， 在反应过程中， 从加人底物( 5 . 3 ) 开始， 向每支试竹中 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G s / T 1 8 6 3 4 一 2 0 0 2 加人试剂的时间间隔要绝对一致， 3 7 C水解 3 0 m i n 反应步骤及试剂、 溶液用量见表 4 0 表 4 反应顺序样液样液空 白标准 1 . 加人待反应液 Z.L2 ml .Zml . 2 . 3 7 预热 ; n u n 训丫罕 3 .依次加人底物( 5 . 3 ) 4 ml 4 m l ( 第 2步) 4 ml 4 .混合 J丫丫 5 . 3 7 (水解 3 0 m u n 州丫甲 6 .依次加人终止液( 5 . 7 ) 4 ml 4 - 1 - ( 第 1 步) 1 ML 7 .混合 丫丫甲 总体积 1 0 -L1 0 m L1 0 m1 , ”标准空白加2 m l ， 乙酸缓冲液( 5 . 1 ) 8 . 2 - 4 样品测定 反应后的试样在室温下静置 1 0 m i n ， 如出现混浊需在离心机( 5 . 7 ) 上以4 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n , 卜 清液以标准曲线的空白调零， 在分光光度计( 6 . 3 ) 4 1 5 n m波长处测定样品空白( A 。 ) 和样品溶液( A) 的吸光值， A -A 。 为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。 9 结果计算和表示 9 门植酸酶活性U按式( i 和式( 2)计算 9 门门绝对法 c 了 = ( 刀于x丽X F . . . . . . . . . . . . . . 。 一 (1) U一试样中植酸酶的活性， U / g ; 、 一 一根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性， U; F一 一试样溶液反应前的总稀释倍数; m 一一 试样质量, g ; 3 0 - 一 反应