细胞实验方法原理.doc

一、 细胞培养：1. 细胞培养：从活的机体中取出组织或细胞，分散成单个细胞，模拟机体内的生长条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等， 使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并维持其结构和功能的技术。2. 细胞培养的基本条件：无菌条件、细胞生长条件、细胞检测条件、细胞保存条件。3. 无菌条件： 1）净化工作室：净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。 细胞培养间：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。每周乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒洁净层流罩：层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化的设备。主要由箱体、风机、初效空气过滤器、中效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成。传递窗：该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数， 把对洁净区的污染降低到最低程度。无尘服层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。相关制度：I.准入制度：没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作。 进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。II.安全制度：谨慎使用酒精灯，实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修。离开时断开必要的仪器电源。III.卫生消毒制度：一般情况下细胞间每天消毒一次，方法为紫外线消毒（ 每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟； 实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；层流净化室实施值日生负责制。IV.出入制度：总体原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。 所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行，紫外灯照射15分钟2）无菌操作的仪器设备：超净工作台：工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 使用前开启柜内紫外灯照射1030分钟， 预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。生物安全柜：既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢， 保护周围环境及操作人员安全。广泛应用于低、中等危险度（病原体1-3，DNA重组P1-P3）的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。高压灭菌锅：121，20min，适用于耐高温耐高压，不怕潮湿的物品（器械、细菌培养基等）电热干燥箱：干热消毒，主要用于玻璃器皿消毒。紫外线：主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。过滤除菌设备：0.45um和0.22um滤膜，大多数培养用液， 如人工合成培养基、 血清、 酶液等均采用滤过法除菌。4. 培养细胞的生长条件：营养需要、生存环境（37、5%CO2、pH7.2-7.4）、无污染、无毒 玻璃器皿的清洗：浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤 浸泡（自来水）刷洗（洗衣粉）泡酸（ 24小时）流水冲洗蒸溜水浸泡和冲洗60-80 烘干 CO2培养箱：37，5%CO2，用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气；保持培养箱内空气干净，定期消毒（90 ，14 h)；箱内蒸馏水槽中保持足够的灭菌蒸馏水以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。 水：一级水：基本上不含有溶解或胶态离子杂质及有机物。二级水经过石英设备蒸馏或离子交换混合床处理后， 再经0.2um 微孔滤膜过滤来制取。 一级水用于有严格要求的分析试验，包括对颗粒有要求的试验，如高压液相色谱用水。 二级水：可含有微量的无机、有机或胶态杂质。可用多次蒸馏或离子交换等方法制取。二级水用于无机痕 分析等试验 量分析等试验， 如原子吸收光谱分析用水。 三级水：适用一般实验室实验工作。可以用蒸馏、离子交换等方法制取。 平衡盐溶液：主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度，提供细胞生存所需的无机离子， 主要作为合成培养基的基础溶液以及用于洗涤细胞组织等。常用：生理盐水（0.9%），PBS，Hanks液Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于配制配制培养液、稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞、组织培养液。 pH调节液：碳酸氢钠 HEPES：一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂，通常使用浓度为1015 mM。消化液：胰蛋白酶溶液：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来，常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶，不含Ca2+Mg2+血清的平衡盐溶液配制，pH8左右，滤器过滤除菌。 EDTA溶液：作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液，EDTA溶液的使用浓度为0.02%， Hanks液溶解后高压灭菌，配制时应加碱助溶（EDTA不能被血清中和）。胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织， 因此不容易对细胞产生损伤， 不受Ca2+Mg2+血清抑制， 可采用磷酸缓冲液配制。 抗生素溶液：通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 培养基：是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点： 营养成分丰富， 培养效果好缺点： 来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 RPMI-1640适用于悬浮细胞培养，主要针对淋巴细胞。DMEM（H）高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等 血清：人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：多种蛋白质、多种金属离子、激素、促贴附生长物质、各种生长因子、转移蛋白、不明成分。 质量鉴定：a.理化性质：如如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、 血红蛋白含量等。 其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。 血红蛋白也是越低越好。 b. 微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22um的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多， 如培养法、 PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。 常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清品质最高。 优质血清的标准：透明、淡黄色、无沉淀物、无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（ 消除补体活性） 56 30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 逐步解冻法：20 或70 至4 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。勿直接由20 至37 解冻， 因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 谷氨酰胺：细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。 完全培养基的组成：基础培养基、血清、青/链霉素(各100单位/mL)、碳酸氢钠(2g/L)、谷氨酰胺、生长因子。每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，2-8保存 无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充成分组成。5. 细胞检测条件：倒置显微镜、酶标仪、微孔板震荡器、高速离心机、移液器6. 细胞保存条件：液氮罐、冻存管二、细胞培养的基本技术1. 无菌操作技术antiseptic technique：工作环境及表面的处理、细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理、培养液的处理、实验者的操作技术。 1）常用细胞培养相关物品的灭菌方法：培养液等易失活物质：过滤；抗生素平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121,20 分钟；过滤布类、玻璃制品、金属器械、细胞培养耗材等： 121,20分钟，然后烘干；玻璃瓶：干热灭菌170, 4 小时。操作台面： 紫外线； 70%酒精涂擦实验者：70%酒精涂擦2）无菌培养室每天紫外线照射消毒30-50min 每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟。超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗，然后紫外线消毒10-30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线应尽量避免瓶口在超净台中敞开直立同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系2. 培养细胞的观察： 1）肉眼观察培养物颜色及浑浊度 2）倒置显微镜观察细胞生长状态3. 体外细胞培养分型： 1）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多型细胞型。 2）悬浮型：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血、脾或骨髓，尤以血中白细胞癌细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形、单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞) 3）培养细胞的“一代生存期”：从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间。a.潜伏期(latent phase)b.对数生长期(logarithmic growth phase)c.停滞期(stagnate phase)4. 细胞传代：体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养 一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1)悬浮生长细胞传代：离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液混匀后再传代。2)半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）：此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3)贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。5. 细胞计数：培养的细胞在 般条件下要求有 定的密度才能生长良好 一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每mL细胞数表示。血细胞计数板： 手工计数细胞。细胞数/ml4大格细胞总数/ 4稀释倍数104镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液；最适浓度为510105细胞/ ml，此范围外计数误差偏大。血球计数仪：自动计数6. 细胞活力的测定：总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。活细胞率 =（细胞总数-死细胞数）/ 细胞总数100%台盼蓝法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。7. 细胞冻存和复苏：细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其原则是慢冻快融。 1）常用的低温保护剂是DMSO（终浓度5-20%）， 它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）常用冻存液：包含10二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基 2）慢冻程序：标准程序：当温度在-25以上时，1 2/min当温度达-25以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中 一般程序：先将冻存管放入4冰箱，约30min；接着置于-20冰箱，约1-2h；置于-80超低温冰箱中放置过夜；置于液氮罐中长期保存。 简易法：-80冰箱过夜；液氮罐长期保存。8.培养细胞的污染和检测：1）细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、 操作室环境不佳、 污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。2）在出现以下情况时培养的细胞可能有污染： 培养液的酸碱度发生异常的改变 培养液出现混浊 光镜观察到菌丝和颗粒 细胞出现死亡或增殖缓慢等3）细菌的污染和检测：肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法、PCR检测法培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊、pH下降。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。4）真菌的污染和检测：真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。5）支原体的污染和检测：支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后， 部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。a. DNA荧光染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之(A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（5580%）， 所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一荧光小点，即为支原体DNA，证明有支原体污染。特点简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。b. 扫描电镜法6）病毒的污染和检测：细胞的直接观察；动物接种检查；电子显微镜观察；免疫学检查；PCR技术7）非同种细胞的污染8）黑胶虫污染9）污染的清除：a. 细菌/真菌：抗生素，预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。b.支原体：I. 用MRA处理细胞，效果好；II. 用清洗纯化法清除支原体污染，结合敏感抗生素，可达到更好的效果；III. 药物辅助加温处理，对细胞有不良影响；IV. 使用支原体特异性血清，比较麻烦。9. 原代细胞培养技术： 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 1）原代培养（primary culture），也称初代培养。即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程， 恢复了分裂增殖与生长发育的能力。 特点：a. 性质：I. 性状似体内，II.细胞异质性，III.细胞活跃移动，分裂不旺盛；IV.相互依赖型强，独立生存能力差，不易单个培养。 b. 发展过程：调整组成，经过选择，形成相对均一的细胞系。 意义：a. 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 b. 利用原代培养做各种实验， 如药物测试、 细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。 c. 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。 2）原代细胞的取材：基本要求： a. 注意新鲜和保鲜（取材时尽量能在46h内制作成细胞） b. 严格无菌 c. 用锋利的器械切碎组织，减少对细胞的机械损伤 d. 去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织 e. 尽量选用易培养的组织进行培养 （胚胎组织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组织，肿瘤组织易于正常组织。） 3）原代细胞的分离： a. 细胞悬液的分离方法：培养材料为血液、 羊水、 胸水和腹水等细胞悬液时， 可采用离心法分离。一般用5001000rpm的低转速，时间约510min。如果一次离心样品量很多，时间可适当延长，但离心速度过大、 时间过长， 会挤压细胞造成损伤甚至死亡。 b. 实体组织块的分离方法：培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用机械法/消化法等使组织进一步分散，以获得细胞悬液。 机械分散法： 消化分离法：I.酶消化分离法:常用胰蛋白酶和胶原酶；II.非酶消化分离法:EDTA法 步骤：剪切-把组织块切碎；漂洗-无钙镁PBS洗2/3次；消化-加入消化液（胰酶/胶原酶/EDTA）于37中适当时间；弃消化液-倾斜自然沉降或低速离心法；终止、漂洗-加入含有血清的培养基终止消化，漂洗2/3次后加入完全培养基；机械分散-采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开以后用纱网过滤分瓶培养。 注意事项：I. 组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰酶的抑制作用。II. 胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。III. 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。 贴块培养法：血管平滑肌细胞 c. 密度梯度离心（density gradient centrifugation）：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 淋巴细胞与单核细胞：1.070 粒细胞和红细胞：1.092 常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、 Percoll淋巴细胞分离液。 4）原代细胞的纯化： a. 自然纯化：即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。 无法人为选择细胞，时间长。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 b. 人工纯化：酶消化法（利用细胞对酶的耐受性不同）、反复贴壁法（利用细胞的贴壁速度不同）、培养及限定方法（某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质）、流式分选 5）体外肿瘤细胞原代培养：三个显著特征：不受控增殖性、永生性、致瘤性 6）癌细胞原代培养：a.成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等b.关键问题：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。I.成纤维细胞过度生长的去除：常采用机械刮除法、反复贴壁法、胶原酶消化法等II.选择性培养基：提高癌细胞体外存活，抑制成纤维细胞过度生长III.饲养层：在培养器皿底部接种能形成接触性抑制的成纤维细胞饲养层，可以有利于癌细胞生长和抑制癌组织中正常成纤维细胞过度生长。7）动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。培养方式：分批式培养、流加式培养（分批补料培养）、半连续式培养、连续式培养支持条件：细胞培养瓶、细胞培养罐、微载体、无血清培养基三、转染技术1.转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。 转染技术的应用：基因的结构和功能分析、基因表达与调控、蛋白相互作用与胞内定位、基因治疗与转基因动物2.转染方法：化学介导：磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法脂质体转染方法、纳米颗粒作为载体的转染物理介导：电穿孔法、显微注射生物介导：病毒介导的转染3.电穿孔法：通过把 与 细胞与DNA共同放入电转杯中，利用高压电脉冲促使细胞膜形成小孔，从而使DNA进入细胞优点：转染效率较高缺点：需要昂贵的仪器（ 电穿孔仪） 。对细胞的损伤较大， 每次转染需要更多的细胞和DNA。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要， 因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞注意事项：选择合适的程序；由于试剂盒中的转染buffer有一定的程度的低渗，所以细胞在转染buffer中的时间尽可能短，操作迅速；动作要轻柔。4.显微注射法：（ microinjection） 是利用管尖极细（0.1至0.5m）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。优点：显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。适用于制备转基因动物。缺点：设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。 不适合大量转染细胞研究的需要。5.磷酸钙共沉淀法：氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。优点：便宜，对某些细胞转染效率高（293T等）缺点：细胞有限制性；重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。6.DEAE-葡聚糖法：DEAE-dextran可以促使DNA结合到细胞膜上，然后通过内吞作用(endocytosis)进入细胞。基于DEAEdextran的细胞转染方法适用于瞬时转染(transient tranfection)，但不适用于筛选稳定表达细胞株。DEAEdextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。一种方法为把DNA和DEAE-dextran混合后加入到细胞中，另一种方法为先用DEAE-dextran预处理细胞，然后再加入DNA。优点：相对简单；重复性比磷酸钙沉淀法好；基于DEAE-dextran的细胞转染方法不仅可以转染贴壁细胞也可以转染悬浮细胞。缺点：浓度高时有一定细胞毒性；不适用于稳定转染，转染时要除掉血清。7.脂质体转染：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层， 又称为人工生物膜。优点：适用于把DNA转入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染； 转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍； 能够把DNA和RNA转染到各种细胞； 转染的稳定性好，可重复性高。缺点：价格较贵，不适应于大批量转染； 阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。注意事项：a.细胞密度，70%-90%融合度为佳 b.需用无血清培养基 c.换液，降低毒性 d.每种细胞的DNA与脂质体的比例需要优化。8.纳米颗粒介导的转染：利用纳米颗粒吸附或者包裹DNA9.病毒介导的转染：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒载体，适用于其他方法较难转染的原代细胞，特别是免疫相关细胞，比如巨噬细胞和树突状细胞。利用产生的“假病毒”颗粒感染靶细胞，从而把目的基因导入细胞。10.腺病毒：无包膜的线性双链DNA病毒， 在自然界分布广泛。其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（ITR），ITR内侧为病毒包装信号。E1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。 E3为复制非必须区，其缺失则可以大大地扩大插入容量。构建腺病毒的要素：a.腺病毒基因组质粒（骨架质粒）：保留了腺病毒大部分基因，但是缺失了E1，E3和包装信号缺失了E1区，不能独立复制；b.穿梭质粒：含有多克隆位点缺失E1，不能复制有包装信号；c.目的基因片段d.包装细胞：293或293T（由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原）293细胞是一株转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，可以持久地分泌产生腺病毒E1蛋白， 激活同源重组体产生包装腺病毒。故293细胞是生产、扩增腺病毒的必要条件方法步骤及关键点：将目的基因克隆到穿梭质粒在大肠杆菌BJ-5183中制备重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒高滴度重组腺病毒的扩增和纯化腺病毒载体特点：I.插入DNA片段较长II.宿主范围广，可感染分裂和非分裂细胞对人致病性低III.不整合到染色体中， 无插入致突变性IV.能同时表达多个基因V.与人类基因同源， 故其表达的蛋白产物能够有效折叠和修饰VI.能有效进行增殖，滴度高，外源基因表达效率高VII.病毒颗粒稳定， 易于浓缩和纯化VIII.表达时间短，需反复刺激IX.具有免疫原性，可能刺激宿主11.逆转录病毒：是RNA病毒，但有逆转录酶，可使RNA转录为DNA,再整合到宿主细胞基因组。它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白特点：就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene）都能够在细胞中转录；逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。优点：能够整合到宿主细胞，形成稳定表达；假病毒。缺点：只能感染能够分裂的细胞；整合的时候会导致宿主基因组突变，有潜在的致瘤性。12.慢病毒：（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。 区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。优点：分裂细胞和非分裂细胞均能感染；能够整合到基因组；免疫原性弱。缺点：整合时同样有可能导致宿主基因组突变13.转染效率的检测：a.免疫荧光b.流式细胞术c. Western Blot d. PCR14.瞬时转染：是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。外源基因导入细胞1-2天后收获细胞进行检测和分析。一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达。稳定转染：DNA整合到宿主细胞的染色体中。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染常用的筛选药物：G418，zeocin，Puromycin等。最常用：G418-一种氨基糖苷类抗生素，它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素。筛选阳性细胞克隆：筛选之前确定G418浓度加药时间和维持浓度挑选单克隆的优化筛选后鉴定转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上） 还表达目的蛋白的可以认为是整合了质粒的。15.细胞转染注意事项：a. 如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以7090%（ 贴壁细胞）或2106 -4106细胞/mL（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4小时换一次新鲜培养液.。b. 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8左右。c. 有血清时的转染：在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。d. 培养基中的抗生素：抗生素一般对于真核细胞无毒， 但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。e. 一般在转染后24-48小时，靶基因即在细胞内表达。 根据不同的实验目的，24-48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。f. 如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）等。16.影响细胞转染的主要因素：a.细胞状态：健康的细胞培养物是成功转染的基础。高的转染效率需要一定的细胞密度。一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。b.血清：血清质量的变化直接影响转染效率。脂质体转染在有血清存在情况下效率较低，因为血清会影响复合物的形成。 因此在转染前最好去除血清。c.DNA质量：DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。d.转染技术：转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。17.细胞转染常见问题：a.转染效率低：I. 没有使用优化条件：优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。 II. 存在抑制剂：不要在用于制备DNA阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素， EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI， 硫酸软骨素， 透明质酸， 硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。 III. 不恰当的细胞密度：转染时融合度应为70%90%。 IV. 阳离子脂质体试剂冻结：不要使用冻结的或储存温度低于4的阳离子脂质体试剂。 V.质粒纯化的问题。b.细胞死亡率高：I.DNA量太高 II.阳离子脂质体试剂量太高 III. 在转染过程中使用抗菌素： 在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。 IV.细胞太少 V. 对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快：在加入筛选性抗生素前至少预留2448小时使细胞表达抗性基因。四、基因沉默技术1.基因沉默技术：从DNA或者RNA水平抑制基因表达的技术。主要包括：基因打靶技术、反义寡核苷酸技术、锌指核酸酶技术和TALEN技术、RNAi技术。2.基因打靶技术：基因打靶是利用DNA同源重组原理， 在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（gene knock in）。基因敲除：主要目的是为了抑制某个基因的表达。基因敲入：引入某个基因的表达（疾病基因），也可以用来抑制某个基因的表达。同源重组(homologous recombination): 是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组:发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。基因打靶技术步骤：a.构建打靶载体；b.将载体导入ES细胞；c.将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎；d.将10-20个胚泡植入小鼠子宫；e.获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。常用方法：PCR、Southern印迹、Northern印迹；f.杂合小鼠（+/-）间杂交，获得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）；g.筛选的-/-、+/-子二代小鼠。3.反义寡核苷酸：是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱基互补原理，与目的基因的DNA或者mRNA结合。目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。 其机制为:(1)在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA 结合,从复制与转录水平发挥反义阻止作用。(2)阻碍mRNA与核糖体的结合,从而阻碍翻译(3)改变mRNA 的二级结构,从而阻碍核糖体的结合;(4)与mRNA 的5末端编码区(主要是起始密码AUG) 结合,阻止RNA 的翻译;(5) 结合到前体RNA的外显子和内含子的连接区,阻止其剪切成熟;(6) 作用于mRNA 的poly A 形成位点, 阻止成熟和转运4.锌指酶技术：锌指核酸酶能够识别并结合指定的位点，高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程“同源定向修复”或“非同源末端连接”来治愈靶的断裂，就能够进行基因组编辑，包括基因修复、基因删除和定向的基因添加。锌指核酸酶（ZFN）：由一个DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。优点：传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有10-6，而锌指核酸酶的基因敲除效率能达到1-20%；周期短；可构建knockout细胞；缺点：价格昂贵5.TALEN（Transcription activator-like effector nucleases,转录激活子样效应因子核酸酶）：一种人工核酸酶，是用于定向基因打靶的一种新技术，有转录激活子样效应因子（TALE）和核酸酶构成。TALE蛋白中间含有一个重复区域，该区域由3335个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守，除了第12位和13位的两个氨基酸可变， 即重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基，有如下一一对应关系： NI = A, HD = C,NG = T,NN = G/A。核酸酶（nucleases）:主要是Fok I，一种IIS型的核酸内切酶，具有特异的识别位点结构域(突变)和切割位点结构域，二聚化后才具有切割活性。基本流程：a.确定靶点，选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点，靶点识别单元串联b.TAL靶点识别域的克隆构建c.将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶d.将重组真核表达质粒转入（卵） 细胞e.筛选突变体6. CRISPR-Cas技术：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR/CAS系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的、可遗传的获得性免疫系统。这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA（ 如噬菌体、 质粒）的免疫功能。一个典型的CRISPR/CAS基因座由一个编码Cas蛋白的操纵子以及一个重复拟间隔序列组成。重复拟间隔序列由多个相同的重复序列及穿插其间的间隔序列组成，间隔序列可以特异性地识别外源核酸。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，重复拟间隔序列）：是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。 CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常2148 bp, 重复序列之间被2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space） 与靶基因进行识别。Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR/CAS系统首先将外源核酸加工成一定长度的间隔序列，进而将这些间隔序列整合于其基因组中成簇的短回文重复序列中，形成规律间隔的短回文重复序列（CRISPRs）。当这些序列被转录并加工成成熟的crRNA时， 便可以引导CAS蛋白对再次入侵的外源核酸进行识别以及切割。第一步：间隔序列的获得。当细菌被外来的病毒或质粒入侵时 CRISPR/CAS系统能够识别入侵者携带的外源核酸中的特殊片段（该特殊片段中存在原型间隔序列毗邻基序，即PAM ，并将PAM旁的原型间隔序列加工整合入自身基因组中的CRISPR序列中。第二步：Pre-crRNA的转录与加工。CRISPR转录产生Pre-crRNA， 之后tracerRNA与pre-crRNA结合形成双链复合物。该复合物在Cas9的存在下，被双链RNA特异的核糖核酸内切酶切割，最终产生成熟的crRNAs。第三步：CRISPER系统对入侵核酸的切割。成熟的crRNA、tracerRNA与Cas9结合形成一个三元的沉默复合物。而后三元聚合体在crRNA的引导下与入侵的双链DNA中目的序列进行结合，由Cas9蛋白于原型间隔序列处进行切割，导致入侵噬菌体或质粒DNA降解。优势：只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。u 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。u 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。7.RNA干扰技术：是指细胞利用外源性或内源性小干扰RNA激发相关的酶复合物，对同源性mRNA进行切割、降解，从而在转录后水平阻断基因表达。Dicer是RNase III家族中的一员，能特异识别双链RNA，并以ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解19-21bp的双链RNAs。RNA诱导的沉默复合体-RISC（RNA-induced silencing complex）：由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和降解。第一步（起始阶段）：dsRNA在ATP参与下被Dicer切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（siRNA）。第二步（效应阶段）siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体RISC。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进 步降解 一步降解， 从而干扰基因表达。重要特征：a. RNAi是转录后水平的基因沉默机制；b. RNAi具有很高的特异性；c. 只有dsRNA才能诱导产生RNAi；d. 只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；e. RNAi作用迅速，mRNA快速降解；f. RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂沉默反应。siRNA设计原则：a. AA-N19设计原则: siRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100200 bp至翻译终止密码上游50100 bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA 3端相邻19个核苷酸作为候选siRNA靶位点。b. 建议设计的siRNA不要针对mRNA的5和3端非编码区c. GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。d.设定负对照。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。e. 靶mRNA的二级结构可能对RISC复合物产生空间位阻效应，影响siRNA的干扰活性，在设计时应该尽量避免。f. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA， 以找到最有效的siRNA序列。g. 最后还应将候选siRNA序列在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯 性 一性， 以避免沉默脱靶现象。脱靶(off-target)是指siRNA所引起的除目的序列以外的其它基因沉默的现象。siRNA制备：a. 化学合成：最贵的方法，但是却是最方便的，主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。最适用于：已经找到最有效的s