光谱检测法在生物工程领域的应用及发展前景综述.doc

海 南 大 学课程论文题 目：光谱检测法在生物工程领域的应用及发展前景综述 学 号： 200904123100* 姓 名： 郭冬阳 年 级： 2009级 学 院： 材料与化工学院 系 别： 生物工程系 专 业： 生物工程 指导教师： 赵富春 完成日期： 2012 年 12 月 26 日 摘要根据物质的光谱利用相关的科学仪器来鉴别物质及确定它的化学组成和相对含量的方法叫光谱检测分析其优点是灵敏，迅速。随着生物工程产业研究的迅猛发展，实验室越来越多的用到光谱检测法来进行科研，而光谱分析技术也在随着需要不断地提高。包括我们常用的红外、紫外、可见光光谱检测，X射线，还有原子发射跟吸收光谱检测等等。这些技术的成熟为我们生物工程科研的发展无疑奠定了基础。对于光谱检测所涉接到的相关仪器，及其内部构造做详细说明。通过查阅国内外相关文献，也对于相关检测技术的发展趋势及发展前景也有初步了解。关键词：光谱检测；有色光谱；生物合成；研究进展AbstractThe use of relevant scientific instruments according to the spectrum of the substances to identify substances and to determine its chemical composition and the relative content of the method is called the analysis of the spectral detection. Its advantage is sensitive and rapid. With the rapid development of the bio-engineering industry research laboratories used in an increasing number of spectrum detection method to carry out scientific research, and spectral analysis technology is also with the need to constantly improve. We used infrared, ultraviolet, visible light spectrum detection, detection of X-rays, atomic emission with the absorption spectrum, and so on. Undoubtedly laid the foundation for the maturity of these technologies for the development of bio-engineering research. Spectrometric detection of the received instrument, its internal structure in detail. By consulting the relevant literature, also have a preliminary understanding of the trends and development prospects for the development of detection technology.Keywords：inspire；colored spectroscopy；plasma diagnostics；1、 光谱检测技术的概要利用光谱学的原理和实验方法以确定物质的结构和化学成分的分析方法称为光谱分析法。 英文为spectral analysis或spectrum analysis。各种结构的物质都具有自己的特征光谱，光谱分析法就是利用特征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法。 光谱分析法主要有原子发射光谱法、原子吸收光谱法、紫外-可见吸收光谱法、红外光谱法等。根据电磁辐射的本质，光谱分析又可分为分子光谱和原子光谱。物质吸收波长范围在200760nm区间的电磁辐射能而产生的分子吸收光谱称为该物质的紫外可见吸收光谱，利用紫外可见吸收光谱进行物质的定性、定量分析的方法称为紫外可见分光光度法。其光谱是由于分子之中价电子的跃进而产生的，因此这种吸收光谱决定于分子中价电子的分布和结合情况。其在饲料加工分析领域应用相当广泛，特别是在测定饲料中的铅、铁、铅、铜、锌等离子的含量中的应用。荧光分析也是近年来发展迅速的痕量分析方法，该方法操作简单、快速、灵敏度高、精密度和准确度好，并且线形范围宽，检出限低。2、 光谱检测法的特点及普遍应用光谱分析法开创了化学和分析化学的新纪元，不少化学元素通过光谱分析发现。已广泛地用于地质、冶金、石油、化工、农业、医药、生物化学、环境保护等许多方面。光谱分析法是常用的灵敏、快速、准确的近代仪器分析方法之一。（1）分析速度较快原子发射光谱用于炼钢炉前的分析，可在l2分钟内，同时给出二十多种元素的分析结果。 （2）操作简便有些样品不经任何化学处理，即可直接进行光谱分析，采用计算机技术，有时只需按一下键盘即可自动进行分析、数据处理和打印出分析结果。在毒剂报警、大气污染检测等方面，采用分子光谱法遥测，不需采集样品，在数秒钟内，便可发出警报或检测出污染程度。 （3）不需纯样品只需利用已知谱图，即可进行光谱定性分析。这是光谱分析一个十分突出的优点。 （4）可同时测定多种元素或化合物省去复杂的分离操作。（5）选择性好可测定化学性质相近的元素和化合物。如测定铌、钽、锆、铪和混合稀土氧化物，它们的谱线可分开而不受干扰，成为分析这些化合物的得力工具。 （6）灵敏度高可利用光谱法进行痕量分析。目前，相对灵敏度可达到千万分之一至十亿分之一，绝对灵敏度可达10-8g10-9g。 （7）样品损坏少可用于古物以及刑事侦察等领域。随着新技术的采用（如应用等离子体光源），定量分析的线性范围变宽，使高低含量不同的元素可同时测定。还可以进行微区分析。 局限性：光谱定量分析建立在相对比较的基础上，必须有一套标准样品作为基准，而且要求标准样品的组成和结构状态应与被分析的样品基本一致，这常常比较困难。3、 有色光谱分析检测法3.1 近红外光谱近红外光谱法是利用可见光和红外光之间波长范围的光谱进行分析的方法。近红外反射光或透射光光谱可用于快速测定样品中的蛋白质、脂肪以及DNA测序样品中的染料等物质的含量。采用近红外光谱快速测定法对生物柴油的成分（脂肪酸甲酯、单甘酯、二甘酯、三甘酯和甘油）进行了研究。采用气相色谱方法获得其成分的基础数据，通过偏最小二乘方法与近红外光谱数据进行回归运算，分别建立以文冠果油生物柴油为例的单原料油校正模型及多种原料油生物柴油的混合校正模型，并以花椒油生物柴油为例考察了校正模型的适用性。结果表明： 通过偏最小二乘方法可以建立适合多种原料油生物柴油的通用校正模型。对于新型生物柴油，向校正集中添加10个以上样本，扩充校正模型后，便可较为准确地测定这类新生物柴油样本的成分含量。此方法分析速度快、成本低、操作便捷、重复性好，适合于生物柴油生产过程的中间控制分析。动植物油脂通过酯交换反应得到生物柴油，它是一种长链脂肪酸的单烷基酯，工业上应用的主要是脂肪酸甲酯。生物柴油不含硫和芳烃, 十六烷值高, 润滑性能好，是一种优质清洁燃料。目前，很多国家强制使用生物柴油，促进了生物柴油产业的发展，其产量逐年迅速增长。动植物油脂主要是各种脂肪酸甘油三酯的混合物，在与甲醇的反应过程中会生成脂肪酸单甘酯、二甘酯等中间产物和副产物甘油，影响生物柴油的产率及品质。因此，在生产过程中，需要及时准确地测定脂肪酸甲酯、单甘酯、二甘酯、三甘酯和甘油的含量，以便精确控制反应过程及产品质量。目前，对这些组分的测定均采用气相色谱方法3,4，分析前需对样品进行衍生化(如硅烷化)处理，定性和定量过程较为复杂，操作难度大，分析时间长，不适用于生物柴油生产过程的中间控制分析。近红外光谱法(NIR)不需要对样品进行预处理，操作简单, 分析快速，非常适合油品的定量和定性分析，石油化工业中得到了较为广泛的应用。目前已有将NIR光谱用于测定生物柴油中甲酯、甲醇和甘油等成分的报道，均得到了满意结果。但这些研究所用样本的原料相对单一，建模样本较少，所测定的成分也不完全，且大都是实验室合成的样品，不具有实际的工业应用价值。3.2 实验部分3.2.1 生物柴油样品和仪器收集了224个生物柴油样品，从反应器取样后取其甲酯相，并蒸馏除去(120 )其中的甲醇及少量的水，置于20 mL密封小瓶中保存。其原料油来源分别为花椒油(47个)、苦山杏油(16个)、文冠果油(44个)、地沟油(40个)和酸化油(石炼厂43个、中粮集团34个)。6890气相色谱仪(美国安捷伦公司，氢火焰离子化检测器(FID)，程序升温冷柱头柱上进样系统，UltraAlloyHT1不锈钢毛细柱。Antaris II FTNIR光谱仪(美国Thermo Scientific公司)。3.2.2 基础数据测定采用气相色谱方法4测定生物柴油成分的基础数据，色谱条件：分别采用油酸甲酯、单油酸甘油酯、1,3二油酸甘油酯、三油酸甘油酯作为定性和定量标准。采用双内标法进行定量分析，以正十五烷为内标测定甲酯含量，以三癸酸甘油酯为内标测定甘油、单甘酯、二甘酯和三甘酯的含量。以空白样品池为参比，采集生物柴油样品的NIR谱图，光谱范围400010000 cm-1，分辨率8 cm-1，扫描次数128。3.2.3 数据分析采用石油化工科学研究院编制的“化学计量学软件3.0版”在PC计算机上处理光谱数据。用KS方法将生物柴油样品分为校正集和验证集，其中校正集用于建立分析模型，验证集用于检测模型的准确性。采用马氏距离、光谱残差和最邻近距离3个指标判断模型对未知样本的适用性。校正集的光谱经一阶微分处理后分别与气相色谱测定的成分数据(甘油、甲酯、单甘酯、二甘酯以及三甘酯的质量分数)通过偏最小二乘方法(PLS1)进行回归运算，建立校正模型，PLS所用的最佳主因子数由留一法交互验证所得的预测残差平方和(PRESS值)确定。为考察校正模型的适用性和准确性。本研究对不同种类的生物柴油样品分别进行建模与验证研究，包括：以文冠果油生物柴油为例的单原料油的校正模型与验证;多种原料油的通用校正模型的建立与验证;以花椒油生物柴油为例，研究了NIR光谱校正模型的适用性。3.3 结果与讨论3.3.1 基础数据获取采用2.2节的方法测定生物柴油成分的基础数据。典型的生物柴油样品色谱图见图1;224个生物柴油的成分分布见表1。可见样本的覆盖范围较宽，具有较强的代表性。与标准方法相比，此方法的准确性和重复性较好。3.3.2 近红外光谱解析尽管6类原料油生物柴油的NIR光谱非常相近，但其成分上却存在一定差异。例如，花椒油生物柴油主要是亚麻酸、亚油酸和油酸甲酯; 苦山杏油生物柴油主要是油酸和亚油酸甲酯; 酸化油和地沟油生物柴油则主要是多种脂肪酸甲酯的混合，具体视原料油种类而定。这种差异可以在其NIR光谱的主成分分析(PCA)得分图上表现出来。图3为6类52个有代表性生物柴油样品的前3个主成分得分分布图。从图3可见，不同原料生产的生物柴油有聚类分布的倾向。由于酸化油原料来源复杂，所以其分布较宽。其余4种生物柴油的分布则相对集中。但从整体来看，尽管不同种类生物柴油的NIR光谱之间存在差异，但这些差异并非十分显著，说明脂肪酸基团对光谱会产生一定的影响，但NIR光谱主要反映的是甲酯基团的信息。因此，有可能建立适合多种原料油生物柴油的通用校正模型。3.3.3 校正模型的建立3.3.3.1 文冠果油单原料油模型与验证将44个文冠果油生物柴油样品分为校正集(36个样品)和验证集(8个样品)，考察了不同光谱区间对模型参数的影响，以及单种原料油所建模型的预测准确性。生物柴油在400010000 cm-1范围的光谱包含了OH键的一级倍频、CH键的一级倍频、二级倍频及其合频信息。从图2可以看出，CH一级倍频区(60006550 cm-1)和部分CH第一合频区(45504000 cm-1)的吸光度值超过了1.5 AU，这些区间的光谱吸收强度可能与成分浓度之间存在较强的非线性关系。另外，100009000 cm-1区间的光谱存在较大的噪声，且没有显著的特征吸收。若这些光谱区间参与模型建立，将会使校正模型预测能力下降。表2给出了利用全谱和去除这些光谱区间(即选取45505500 cm-1和65509000 cm-1区间)所建模型及其预测的对比结果。可以看出，选用45505500 cm-1和65509000 cm-1光谱区间建立模型的预测能力明显优于全谱的结果。表2 文冠果油生物柴油不同光谱区间的校正和预测结果比较(略)注(Note)： R2为校正集交互验证得到的相关系数(Correlation coefficient);SECV为校正集交互验证得到的预测标准偏差(Standard error of cross validation);SEP为验证集预测标准偏差(Standard error of prediction)。从单种原料油的建模和预测结果可以看出，对测定生物柴油中的甘油、甲酯、单甘酯、二甘酯和三甘酯的含量，NIR光谱方法可以给出比较准确的结果。3.3.3.2 多种原料油模型与验证若能建立适合所有原料油来源的生物柴油全局校正模型(Global models)，则对该方法的推广和使用都将带来很大的便利。将6种原料油来源的224个生物柴油样品分为校正集(167个样品)和验证集(57个样品)，以考察建立全局模型的可行性。3.3.3.3 多种原料油生物柴油的校正和预测结果采用与文冠果油生物柴油建模相同的条件建立了多种原料油生物柴油的校正模型。表3给出了模型建立过程的交互验证结果和验证集的预测结果; 图4中A,B和C分别为甲酯、单甘酯和二甘酯的NIR光谱交互验证预测值与色谱方法的相关图。与单原料的文冠果油结果相比，由于成分变得相对复杂，光谱之间的干扰更为显著，建立模型所用的主因子数明显增加，同时校正和预测结果都有不同程度的降低。尽管如此，仍得到了满意的结果，完全满足工业生产对过程分析误差的要求。上述结果表明，建立多种原料油来源的生物柴油全局校正模型是完全可行的，但随着模型中原料油种类的增多，成分的复杂性将引起光谱与浓度间的非线性变动关系，PLS方法所建模型的预测准确性将下降。为得到准确性更高的预测结果，需要分别建立单种原料油的PLS校正模型，或采用更为复杂的算法，如局部权重回归、神经网络或支持向量机等建立非线性校正模型。3.3.3.4 模型适用性的研究以花椒油生物柴油为例，研究了多种原料油生物柴油的NIR校正模型对新原料油生物柴油的适用性。若校正集中不含待测类型的样本，其预测结果将会存在一定的系统误差，且模型的适应性判据也会给出提示。为考察向校正集添加少量样本对扩充模型适应性的效果，从47个花椒油生物柴油中任意选取10个样品，用于模型的扩充，剩余37个作为验证集样本。将花椒油生物柴油样本从多种原料油校正集中剔除，建立剩余5种原料油生物柴油的校正模型。然后，再将任意选取的10个花椒油生物柴油样本添加到校正集中，建立含有10个花椒油生物柴油的多原料油生物柴油的校正模型。用以上建立的两类模型分别对37个验证集样本进行预测分析(表4)。由表4可见，未含花椒油生物柴油的模型仍具有较好的预测趋势，但存在一定的系统误差，预测准确性也有明显下降。当模型中添加了10个花椒油生物柴油样本后，消除了系统误差，且预测准确性有了显著改善，与3.3.2节建立的模型基本相当。上述结果说明，对于模型中未含的新类型原料油生物柴油样本，只需向多种原料油校正集中添加10个以上样本便可较为准确地测定新类型生物柴油的成分。表4 不同校正模型对37个花椒油生物柴油的预测结果(略)3.3.4 近红外分析方法的重复性由于光谱测量的稳定性，NIR分析方法具有良好的重复性。随机选取一个样本重复扫描7次的NIR光谱，并分别调用建立的多种原料油的生物柴油模型，其质量分数的相对标准偏差分别为：甘油0.74%，甲酯0.26%，单甘酯2.86%，二甘酯0.70%，三甘酯1.41%。说明采用NIR分析方法测定混合油生物柴油的成分具有较高的精密度。3.3.5 小结通过以上研究，可以得到以下结论：(1)通过偏最小二乘方法可以建立适合多种原料油生物柴油的通用近红外校正模型，其结果完全满足过程控制分析的要求。但若想得到更准确的预测结果，需要建立单种原料油的PLS校正模型，或者采用更为复杂的校正算法; (2)对于新型生物柴油，只需向校正集添加少量样本，扩充模型覆盖范围后，便可较为准确地对该类样本进行预测分析。这样，基于本研究建立的这些基础校正模型，针对新类型原料油或加工工艺，只需添加少量样本，便可直接应用于生物柴油的实际工业生产中; (3)近红外光谱方法有望较好解决生物柴油传统分析方法的诸多弊端，可以快速准确地测定生物柴油的主要成分含量，适合于生物柴油生产过程的中间控制分析。3.4 近红外光谱仪对于生物柴油的研究，实验室一般采用的近红外光谱仪做以下简介3.4.1 优点3.4.1.1性能好-带冷却系统的512像素InGaAs阵列探测器的工作波长可0.91.7um，扩展波长范围后可达1.02.1 um； 3.4.1.2 数据快-数据获取速率：1 ms；3.4.1.3 集成化设计-光谱仪和16位A/D转换器装配在同一机壳内； 3.4.1.4 流水线启动软件-可自动读取光谱仪的校准系数和设置光谱仪运行软件； 3.4.1.5即插即用型接口-可直接插入任何台式电脑或笔记本电脑的USB接口，也可通过串行口与台式电脑、笔记本电脑或掌上电脑相连。NIR512近红外微型光纤光谱仪是一种微型即插即用式光谱仪，用于近红外区域的光谱分析，比如可调激光器的波长特性、湿度分析、普通的近红外光谱分析等。NIR512光谱仪配有带冷却系统的512像素InGaAs阵列探测器，其有效探测波长为：0.9-1.7um，光谱分辨率：3.0nm FWHM。 3.4.2带冷却系统的探测器设计InGaAs线型阵列探测器带有热电冷却装置。通过热敏电阻检测探测器阵列的温度，通过热电装置将探测器温度冷却至比周围温度低40，并使探测器保持0.1的温度稳定性。而且，您还可以通过OOIBase32运行软件设置并监控探测器的温度。 3.4.3集成化设计NIR512光谱仪以衍射光栅为基础的光纤模块和16位USB A/D转换器装配在同一机壳内，这种集成化的设计使NIR512光谱仪尺寸微小（153mm105mm），且不需外置光谱仪与A/D转换器的连接线缆。此外还备有A5直流变压器（已包括），用于运行高性能InGaAs探测器。3.4.3.1可热插拔NIR512光谱仪与计算机通过USB接口相连，可支持光谱仪的热插拔（即快速转换）。只要将OOIBase32光谱仪运行软件在电脑里安装好并连接好NIR512光纤光谱仪，光谱仪运行软件即可识别并读取NIR512光谱仪存储器中的专有参数，并可进行参数调整以适合每个特定的光谱仪。这样既可节省时间，又可减少设置错误。NIR512还备有串行接口与台式电脑、笔记本电脑或掌上电脑相连。3.4.3.2兼容性NIR512光谱仪带有SMA905连接口，可与我们的光纤、样品池固定座、探头等其它附件完全兼容。这里还推荐使用我们的LS-1卤化钨光源或HL-2000-HP高功率卤化钨光源作为NIR512的配套光源。4、 光谱检测的发展前景近红外光谱分析的发展前景虽然近红外光谱分析还有不足,但是由于近红外光谱法的快速、非破坏性、无试剂分析、安全、高效、低成本及同时测定多种组分等特点,使它成为农业、医药、石油生产等领域经济、有效且最具发展前景的分析技术之一。根据近红外分析技术的特点,应大力发展近红外在线检测及网络联用。在线检测是及时发现和解决生产中质量问题的最有效途径。光导纤维及传感技术的发展,使NIRS在线检测在企业的生产过程中获得广泛的应用。同时将近红外分析技术与网络技术相结合,不仅可以实现异地定标、异地检测及资料共享,同时也有利于模型传输和远程分析,提高分析结果的准确性。由此可见,近红外光谱分析技术的应用在我国有良好的发展前景,必将为农业、工业等各个领域带来较大的经济效益和社会效益。参考文献【1】张玲. 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