植物激素脱落酸ABA受体的研究.doc

植物激素脱落酸ABA受体的研究摘要 脱落酸ABA(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素，参与高等植物生长发育、抗逆等诸多生理过程。近些年发现的能与ABA结合并发挥受体功能的有FCA（Flowering Control Locus A）、ABAR/CHLH(Mg离子螯合酶H亚基)、GCR2（G蛋白偶联受体）、GTG1/2（GPCR-type G protein 1/2）和PYR/PYL/RCAR (pyrabactin resistantPYR-likeregulatory component of ABA)，其中PYR/PYL/RCAR被普遍认为是真正的ABA受体蛋白。目前ABA受体的研究主要集中在拟南芥和水稻等几个模式植物中。本文概述了以上几种ABA受体的研究进展，重点介绍以PYR/PYL/RCAR为受体在ABA信号传导途径中的作用模式，旨在为ABA受体及其信号转导通路的相关研究提供参考。关键词 脱落酸；ABA受体；信号转导Research on Abscisic Acid（ABA）Receptor in plantsAbstract Abscisic acid (ABA) is a key plant stress hormone，which involved in many important processes of growth and development in higher plants. Recent years, FCA（Flowering Control Locus A）, ABAR/CHLH(H subunit of the chloroplast Mg2+-chelatase), GCR2（ G-protein Coupled Receptor）、GTG1/2（GPCR-type G protein 1/2），PYR/PYL/RCAR(pyrabactin resistantPYR-likeregulatory component of ABA) was found cound bond with ABA and function as ABA Receptor. PYR/ PYL/ RCAR is considered to be the most widely studied ABA receptor . Currently, most research focuses on several model plants such as Arabidopsis and rice. This paper describes the research progress of several kind of ABA receptor above, highlighting the PYR / PYL / RCAR as ABA receptors in the mode of action of the ABA signal transduction pathway, To research for the ABA receptor and its signal transduction pathway.Key words abscisic acid, ABA receptor, signal transduction.1 ABA激素的发现ABA广泛产生于自然界的真菌，植物以及一些后生动物中1,2，在被子植物中首次被发现并被很好地被阐述3。1963年F.T.addincontt等于棉铃中提纯了一种能显著促进棉苗外植体叶柄脱落的物质4，后证实该物质即为脱落酸（abscisic acid, ABA），它是一种含15个碳原子的倍半萜类化合物植物激素。ABA在植物体内的天然形式是2顺-4反(+) ABA，构型见图1。图 1 植物体内ABA的构型ABA是一种非常重要的植物激素，参与高等植物生长发育的多个重要过程，如胚胎发生、种子发育、贮藏蛋白合成、种子休眠的诱导和维持、种子萌发、侧根发生、叶片脱落、器官衰老、气孔关闭等5-10。此外，当植物遭受各种非生物和生物胁迫，如干旱、寒冷、盐胁迫、渗透压胁迫、病原物侵染等， ABA的含量会迅速增加，导致气孔关闭，减少水分蒸腾，激活编码可溶性渗透保护物质等基因降低胁迫伤害，减少胁迫诱导的乙烯、活性氧对植物生长的影响 11-14，因此ABA常被称作胁迫激素。随着胁迫因素的消失，ABA含量又恢复到胁迫前的水平。由此可见，植物体内ABA含量和信号对调节植物逆境反应以及生长发育有着重要的意义。ABA信号转导作用机制的研究一直是植物逆境生物学的重要课题，根据拟南芥基因组的研究，特别启用了已鉴定出的介导ABA信号转导的关键元件，包括蛋白激酶，磷酸酶，转录因子，RNA加工因子，蛋白酶，染色质重组蛋白和介导表观遗传调控的组蛋白去乙酰化酶等15-17。然而， ABA信号转导还依然存在许多的问题。2 ABA受体的研究1983年 Hartung的一个开创性的研究报告为ABA的结合以及其在野苣细胞表面的结合位点的存在提供了初步证据。作者得出质子化的ABA可以通过质膜扩散，而非质子化的ABA则不能，两种形式的ABA都能促进气孔关闭。这些结果表明，通过质膜扩散可能不是ABA激发应答所必需的。 后来以质膜研究独立的ABA结合蛋白，为ABA结合蛋白的存在进一步提供了证据18-19，应该指出的是最近发现一些ABA膜结合蛋白在早期居然可以作为ABA转运蛋白行使功能20-21。研究发现，膜感受位点足以引发水稻22和拟南芥悬浮细胞23-24中ABA应答基因的表达，并改变拟南芥悬浮细胞中阴离子和K+的流通23。后来，Yamazaki等人利用生物素-ABA共轭结合荧光标记的抗生素蛋白以及利用荧光显微技术直观的展示了膜表面ABA的结合。这些研究都指出质膜上存在着ABA感受位点。与此同时，一些调查显示细胞质中也存在ABA感受位点，例如，显微注射到鸭跖草保卫细胞的ABA被发现足以引起气孔关闭26,27，然而另一个研究组则在类似的研究中得出了相反的结论28。Levechenko等发现，虽然外施ABA能激活保卫细胞阴离子通道，但将ABA注射进入细胞质激活阴离子通道更快，更加明显，这表明存在一个内在的ABA感应位点29。按照这些早期的研究结果，最新的研究已经确定存在两种类型的质膜ABA受体30-31，叶绿体ABA受体32，细胞质/细胞核ABA受体33。自2006年FCA被报道为ABA受体以来35，相继报道了ABAR/CHLH、GCR2、GTGl/2和PYR/PYL/RCAR是ABA的受体蛋白，为植物中ABA信号转导通路的阐明奠定了重要基础32-34。本文将重点介绍各个受体的研究情况。2.1 FCA在ABA处理过的大麦糊粉中发现一个能够结合ABA的蛋白是ABAP1，该蛋白是第一个被鉴定出来的能够结合ABA的抗体蛋白36。FCA是其在拟南芥中的同源基因，参与ABA信号接收并调控植物开花时间和根的形成过程，但并不参与种子萌发和气孔关闭等典型的ABA反应35。此后Risk等利用3H-ABA与FCA的体外结合实验证明，FCA并不能结合ABA，之前的实验结果不能重复出来37。这些证据导致关于FCA是ABA受体的结论被质疑。 2.2 ABAR，CHLHCHLH是第二个被发现的ABA结合蛋白，最初是在蚕豆的表皮中通过亲和层析被分离出来的38，CHLH是叶绿体镁离子螯合酶的H亚基。拟南芥中与该蛋白同源的基因被命名为ABAR39。ChlH/ABAR可与（+）-ABA特异结合并具有高亲和力，它具有调解ABA应答的重要作用，包括种子萌发，早期幼苗生长发育和气孔运动等32。ABAR编码定位于质体的参与催化叶绿素合成的镁离子螯合酶H亚基CHLH（Mg-chelatase H subunit）32。离子螯合酶催化Mg离子进入原卟啉中形成镁离子-原卟啉，镁离子-原卟啉是叶绿素前体。此酶由CHLH、CHLD和CHLI 3种亚基组成，亚基CHLH具有结合卟啉的功能,它不但可催化细胞叶绿素的合成，而且在应激条件下能够参与质体/叶绿体与细胞核之间的信号反向传递39,40。然而，2009年Muller和Hansson发现大麦中与拟南芥CHLH同源的基因XanF的突变体在种子萌发、幼苗早期生长和气孔运动中都没有表现出相应的ABA相关表型，且XanF的ABA结合活性并没有被检测到，因此他们对至少在大麦中ABAR/CHLH是否为ABA受体提出了质疑41。2009年Wu等又提出了ABAR/CHLH作为ABA受体的新证据，ABAR/CHLH可以通过C末端与ABA特异结合，过表达ABAR/CHLH的C末端蛋白的转基因株系在萌发、幼苗生长和气孔运动中对ABA表现出超敏现象，在ABA不敏感突变体cch中表达该C末端蛋白可以恢复cch所有的ABA表型。他们还鉴定了ABAR/CHLH的两个新的点突变体：abar-2和abar-3，两个突变体在种子萌发和幼苗生长中表现出ABA不敏感表型42。最近有研究表明WRKY（WRKYGQK-containing）转录因子（WRKY40，WRKY18和WRKY60）43可能参与了传递ABAR/CHLH的ABA信号。研究证明：在低浓度的ABA水平，WRKY40通过W-BOX的顺式元件结合，抑制一些转录因子ABI5和DREB2A激活ABA应答43,44，另一方面，当ABA浓度高时则促进转录因子的表达，反过来他们可以激活ABA应答基因的表达。 2.3 GCR2 G蛋白偶联受体(GPCR)是一类能与G蛋白相互作用而形成复合物的蛋白。根据药理学的结果表明植株中可能存在着G蛋白介导的ABA信号转导路径45。研究表明G蛋白偶联受体（GCR1）可能参与ABA信号转导路径，过表达G蛋白偶联受体（GCR1）会使种子的休眠减弱46，然而通过遗传分析GCR1功能缺失突变体发现GCR1基因并不直接参与ABA激素的感应。gcr1缺失突变体对ABA敏感，数据同时表明GCR1基因具有多重效应能够参与到其他的信号路径47。近来发现，在拟南芥基因组中有一种GPCR位于细胞膜上并对ABA具有很高的亲合力，有一个ABA结合位点并具有饱和性，称之为GCR2 (G-protein Coupled Receptor 2) ，GCR2作为ABA受体的鉴定始于对GCR2蛋白生物信息学分析，预测其含有7个跨膜结构域，哺乳动物细胞中也具有这一结构特征37。第三个可能的ABA受体被分离出来，这个蛋白可能是G蛋白偶联受体30。研究表明，具有G蛋白耦联受体特征的GCR2蛋白能与(+)-ABA特异性结合，调控拟南芥ABA信号应答反应30。正常情况下GCR2蛋白与G a亚基(G protein a subunit，GPAl)相互作用形成GCR2一GPAl复合物，ABA与GCR2蛋白的特异性结合诱使G蛋白释放，G蛋白随后分离为G和G二聚体，并分别通过作用于其下游的效应因子调控ABA的信号应答反应30。但此后不久，Johnston等的研究结果表明GCR2既不是跨膜蛋白也不是G蛋白偶联受体，而是细菌羊毛硫氨酸合酶在植物中的同源基因48。其他研究团队的结果也表明GCR2在ABA介导的种子萌发和幼苗发育中并不发挥作用49,50。实验证明，拟南芥GPA1缺失突变体的种子萌发表型和突变体的保卫细胞对ABA浓度不敏感，在ABA处理情况下也不能抑制气孔的关闭。目前有关这个基因是否真正参与到ABA信号通路和这个基因是否是G蛋白偶联受体依然存在着争论48-50。2.4 GTGl/GTG2 最近，提出了一类新的G蛋白偶联受体：GTGs（GPCR-type G proteins），作为ABA的受体31，预测GTG蛋白的拓扑结构和G蛋白偶联受体类似。由Ga、G和G三亚基组成的G蛋白协同G蛋白耦联受体及其下游效应因子在响应植物激素信号应答过程中发挥着重要作用51,52。Pandey等首先通过生物信息学分析鉴定出GTG1和GTG2两个基因，这两个蛋白具有9次跨膜结构域，还应当指出的是，典型的G蛋白偶联受体则包含7个跨膜结构域。拟南芥GTGs蛋白包含GTP结合结构域以及GTP酶活性结构域，这通常在典型的G蛋白偶联受体中是不存在的。随后，他们根据GTG重组蛋白在卵磷脂中能够立体特异结合(+)-ABA53，以及相关突变体表型实验，推断GTGl/2是两个位于细胞质膜的ABA受体蛋白。GTGs与拟南芥GPA1互作，GPA1-GTP复合体抑制GTG蛋白的GTPase活性。GDP-GTGs结合ABA的能力比GTP-GTGs强，说明GTG的GDP跃迁状态是高亲和结合状态。ABA不存在的情况下，GPAl-GTP维持GTGs的GTP酶活性，以GTGs-GTP的形式存在，ABA信号不会向下游传导；ABA存在的情况下，GTGs-GDP与ABA结合形成ABA-GTGs-GDP复合体，激活ABA下游信号分子31。拟南芥gtg1/gtg2的双突变体在种子萌发和幼苗生长的时候显现出对ABA的不敏感，气孔应答和ABA诱导基因的表达受ABA激素的影响程度降低。然而，ABA应答在gtg1/gtg2突变体中仍然存在，这意味着存在其他ABA信号感受位点。由于分离功能活性的跨膜蛋白比较困难，ABA结合含量低（0.01 mol ABA/mol protein)，以及拟南芥G蛋白调节路径中的部分GPCR可能会失去感受ABA的功能，因此在拟南芥基因组范围内寻找尽可能多的GPCR基因是十分必要的31,37,53,54。2.5 PYRPYLRCAR虽然利用传统的研究方法未能找出任何ABA受体，但2009年5月，Park等合成了一种经化学基因组学确认的、能够模仿ABA的生长抑制剂pyrabactin55，pyrabactin除了对种子发芽产生抑制作用外，其诱导种子的转录反应也与ABA诱导的转录反应高度相关（r=0.98）。与此相反，其诱导苗期的转录反应相关性却很低。所以， pyrabactin 是类似ABA的一种选择性抑制剂，Park等人使用这种化合物来识别ABA信号元件，在拟南芥中分离出PYRABACTIN RESISTANCE 1（PYR1），PYR1属于START/ Bet v I超家族，具有保守的疏水性配体结合口袋。拟南芥基因组包含13个类似PYR1的基因被命名为PYR1/PYLs（Pyrabactin resistance 1/PYR1 like），是细胞质ABA的受体34,55。在调控种子发芽，根系生长，转录编码和SnRK2（Sucrose non-fermentation kinase subfamily 2）激酶活性过程中，突变体pyl1与野生型没有明显差别；（pyr1, pyl1 ,pyl4）三重突变体以及 (pyr1, pyl1, pyl2, pyl4)四重突变体却对ABA极度不敏感；同时，(pyr1; pyl1; pyl2 pyl4)四重突变体在调控气孔关闭中也对ABA不敏感56。有人利用酵母双杂交以PYR1作诱饵蛋白筛选出HAB1（hypersensitive to ABA 1），HAB1是蛋白磷酸酶PP2Cs (protein phosphatases type-2C)家族成员之一，在ABA信号应答中发挥核心作用57。Santiago等以蛋白磷酸酶HAB1为诱饵筛选到相互作用的蛋白PYL5、PYL6和PYL858，并重点阐明了PYL5作为受体蛋白介导ABA信号应答的分子机制。同时期另一个研究组Ma等利用酵母双杂交筛选出ABI2（PP2C家族成员之一）的互作蛋白PYL9，命名为RCAR1（regulatory components of ABA receptor 1）。后期研究表明RCAR家族共有14个成员，分别为RCAR1-14，作为ABA的受体发挥作用33。实际上，RCARl与PYRl同属定位于细胞核和细胞质的START家族蛋白成员，只是命名方式不同，RCAR1-14即为PYR1，PYL1-13。在早先的研究中，Ma等注意到微摩尔水平的ABA 能使ABI1磷酸酶的活性降低20左右，但没有检测到ABA-ABI1复合物57。当RCAR1存在时，ABA在纳摩尔水平几乎完全抑制了ABI2的磷酸酶活性33。此外，RCAR1的瞬时表达增强了ABA信号应答，以及稳定表达的RCAR1过表达株系在ABA调控的抑制种子发芽，根的伸长和气孔关闭中对ABA敏感。颜宁研究组对已克隆的10个PYR，PYL，RCAR受体蛋白(PYL7、PYLl1和PYLl2除外)进行了系统生化分析，发现有部分受体蛋白无论ABA存在与否都能与蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用并抑制其活性60。随后，Hao等应用生物化学和结构生物学手段分析了受体蛋白PYLl0不依赖ABA抑制蛋白磷酸酶PP2Cs的分子机制，为深入探讨PYRPYLRCAR受体蛋白调控的ABA信号转导通路以及该家族受体蛋白的分类提供了结构和功能依据。总的来说，PYRPYLRCAR的筛选和鉴定无疑是ABA受体研究中的重大突破，它合理地诠释了之前未能完全解释的实验现象。2009年底多篇关于PYR1/PYLs/RCAR的蛋白结构及其如何接收ABA信号并发挥其受体功能的研究成果被报道58,61。Fujii等利用ABA受体PYR1，PP2C家族的磷酸酶ABI1，蛋白激酶SnRK2.6/OST1和转录因子ABF2/AREB1在体外完美的重组了ABA介导的下游转录因子的磷酸化反应，将四种组分转入植物原生质体可以激活ABA响应基因的表达61。研究显示SnRK2的功能状态是自身磷酸化的活性状态，PP2Cs可以与SnRK2结合使其去磷酸化将SnRK2维持在非活性状态。ABA与PYR1/PYLs的结合可以阻止PP2Cs和SnRK2的作用，使SnRK2自身磷酸化而被激活，继而诱导下游转录因子的磷酸化以启动ABA响应基因表达62。图1 ABA信号通路的四个核心组分(Sheard and Zheng, 2009)另外几个研究组在蛋白结晶方面的研究揭示了多个PYR1/PYLs/RCAR家族成员在不同功能状态下的原子结构，由此提出PYR1/PYLs/RCAR与ABA结合的机制。配受体结合受到受体上ABA结合口袋处门控环的开和关的调控。在ABA不存在的情况下，PYR1/PYLs/RCAR表现为一个开放型的可进入的洞穴，两个柔韧的表面环与附近的结构组分共同控制着洞穴入口。ABA启动了门环从开到关的构象转换，当有ABA时，其中的一个门控环被关闭，ABA可以通过另一个环进入并被扣押在口袋中，并使门环的一个疏水性结合位点暴露。PP2C可以结合门控环上的疏水位点，通过一个保守Tyr残基将侧链插入相邻的门控环，并将其锁住。此外，门控环可以与PP2C的底物结合位点及活性位点发生紧密作用，阻断其结合和去磷酸化底物的功能63-66。这些结构特点全面揭示了PYR1/PYLs/RCAR蛋白如何以依赖于ABA的方式抑制PP2Cs的活性，及PP2C如何作为一个辅助受体促进ABA和PYR/PYL的结合活性（图3）62。图3 ABA作用的结构机制 (Sheard and Zheng, 2009)综上所述，PYR1/PYLs/RCAR作为ABA受体目前在国际上已经定论。之前关于PYR1/PYLs/RCAR基因家族的研究主要都是集中在拟南芥上，在这之后又有很多研究团队在其他物种上研究与拟南芥PYR1/PYLs/RCAR同源的基因。在草莓中发现与AtPYR1同源的基因FaPYR1参与到草莓的成熟过程中67。在水稻中过表达与拟南芥PYL5同源基因OsPYL5，会导致水稻种子对ABA的敏感性增强，该基因能和水稻内源PP2Cs基因在BiFC系统和酵母双杂交系统中发生互作68。在葡萄中共计克隆到8个能够和葡萄内源的PP2Cs发生互作的基因（部分依赖于ABA）。ABA是调控植物对于逆境胁迫的重要信号（图4），其信号通路由众多的蛋白质介导，参与了植物对冷胁迫、干旱胁迫和盐胁迫的抵御。ABA受体位于ABA信号的通路的上游，因此它们的遗传学特征和生物学功能对于植物抗逆和发育具有非常重要的意义，但是目前大多实验只是集中在部分物种的部分ABA受体上，关于对一个物种的所有ABA受体家族的研究还比较少，鉴于ABA激素对植物生长发育的重要意义，所以更加全面的研究ABA受体基因，进一步的了解其功能是当今科学研究的一个热门话题。参考文献1 Oritani T, Kiyota H. 2003. 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