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TTULO CORRESPONDENCIA OBSERVACIONES ANTECEDENTES norma espaola UNE-EN ISO 6341 ICS 13.060Noviembre 1996 Calidad del agua Determinacin de la inhibicin de la movilidad de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Ensayo de toxicidad aguda (ISO 6341:1996) Water quality. Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Acute toxicity text. (ISO 6341:1996). Qualit de leau. Dtermination de linhibition de la mobilit de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Essai de toxicit aigu. (ISO 6341:1996). Esta norma es la versin oficial, en espaol, de la Norma Europea EN ISO 6341 de abril 1996, que a su vez adopta ntegramente la Norma Internacional ISO 6341:1996. Esta norma anula y sustituye a la Norma UNE 77-074 de mayo 1994. Esta norma ha sido elaborada por el comit tcnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente cuya Secretara desempea AENOR. Editada e impresa por AENOR Depsito legal: M 39503:1996 AENOR 1996 Reproduccin prohibida LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A: Fernndez de la Hoz, 52Telfono(91) 432 60 00 28010 MADRID-EspaaTelefax(91) 310 36 95 17 Pginas Grupo 13 NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EUROPISCHE NORM EN ISO 6341 Abril 1996 ICS 13.060.00 Descriptores: Agua, calidad, contaminacin del agua, ensayo, ensayo de aguas, ensayo biolgico, determina- cin, toxicidad, dafnia. Versin en espaol Calidad del agua Determinacin de la inhibicin de la movilidad de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Ensayo de toxicidad aguda (ISO 6341:1996) Water quality. Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Acute toxicity text. (ISO 6341:1996). Qualit de leau. Dtermination de linhibition de la mobilit de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Essai de toxicit aigu. (ISO 6341:1996). Wasserbeschaffenheit. Bestimmung der Hemmung der Beweglichkeit von Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Auker To- xizitts-Test. (ISO 6341:1996). Esta Norma Europea ha sido aprobada por CEN el 1996-01-28. Los miembros de CEN estn sometidos al Regla- mento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modifica- cin, la Norma Europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliogrficas relativas a estas normas nacionales, pueden obtenerse en la Secretara Central de CEN, o a travs de sus miembros. Esta Norma Europea existe en tres versiones oficiales (alemn, francs e ingls). Una versin en otra lengua reali- zada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretara Central, tie- ne el mismo rango que aqullas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalizacin de los pases siguientes: Alemania, Austria, Blgica, Dinamarca, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Pases Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. CEN COMIT EUROPEO DE NORMALIZACIN European Committee for Standardization Comit Europen de Normalisation Europisches Komitee fr Normung SECRETARA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles 1996 Derechos de reproduccin reservados a los Miembros de CEN. EN ISO 6341:1996- 4 - ANTECEDENTES El texto de la Norma Internacional ISO 6341:1996 ha sido preparado por el Comit Tcnico ISO/TC 147 Calidad del Agua en colaboracin con el Comit Tcnico CEN/TC 230 Anlisis del Agua cuya Secretara desempea DIN. Esta Norma Europea deber tener rango de Norma Nacional, bien por publicacin de un texto idnti- co, bien por ratificacin lo ms tarde en Octubre de 1996 y todas las Normas Nacionales en con- tradiccin debern retirarse lo ms tarde en Octubre de 1996. Conforme a las Reglas Comunes de CEN/CENELEC, los pases siguientes deben adoptar esta Norma Europea: Alemania, Austria, Blgica, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Luxem- burgo, Noruega, Pases Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. DECLARACIN El texto de la Norma Internacional ISO 6341:1996 ha sido aprobada por CEN como Norma Europea sin ninguna modificacin. NOTA Las referencias normativas a las publicaciones internacionales se relacionan en el Anexo ZA (normativo). - 5 -ISO 6341:1996 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN Esta Norma Internacional describe un mtodo para la determinacin de la toxicidad aguda frente a Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) de: a)sustancias qumicas solubles en las condiciones del ensayo, o que pueden mantenerse en suspensin o en dis- persin estable en las condiciones de ensayo; b)efluentes industriales o urbanos, tratados o no, despus de decantacin, filtracin o centrifugacin, si es nece- sario; c)aguas superficiales o aguas subterrneas. 2 NORMAS PARA CONSULTA Esta Norma Europea incorpora disposiciones de otras publicaciones por su referencia, con o sin fecha. Estas refe- rencias normativas se citan en los lugares apropiados del texto de la norma y se relacionan a continuacin. Las re- visiones o modificaciones posteriores de cualquiera de las publicaciones citadas con fecha, slo se aplican a esta Norma Europea cuando se incorporan mediante revisin o modificacin. Para las referencias sin fecha se aplica la ltima edicin de esa publicacin. ISO 5667-2:1991 Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Gua para las tcnicas de muestreo. ISO 5725-2:1994 Exactitud (justeza y precisin) de los mtodos de medicin y resultados. Parte 2: Mtodo bsico para la determinacin de la repetibilidad y reproducibilidad de un mtodo de medicin normalizado. ISO 5813:1983 Calidad del agua. Determinacin del oxgeno disuelto. Mtodo yodomtrico. ISO 5814:1990 Calidad del agua. Determinacin del oxgeno disuelto. Mtodo electroqumico. 3 PRINCIPIO DEL MTODO Se determina, en las condiciones definidas en esta Norma Internacional la concentracin inicial (es decir, la con- centracin presente al inicio del ensayo) que, en 24 h, inmoviliza el 50% de las Daphnia magna expuestas a ensayo. Esta concentracin conocida como concentracin eficaz inicial inhibitoria, se designa por CE50i 24 h. Si es posible y necesario, se puede determinar tambin la concentracin inicial que en 48 h inmoviliza el 50% de las Daphnia magna expuestas a ensayo. Esta concentracin se designa por CE50i 48 h. En los casos donde no sea posible determinar la CE50i 24 h (y eventualmente la CE50i 48 h), debera indicarse la concentracin ms pequea que inmoviliza todas las Daphnia magna y la concentracin ms alta ensayada que no inmoviliza ninguna, ya que constituye una informacin til. El ensayo se realiza en una o dos etapas: un ensayo preliminar que proporciona un valor aproximado de la CE50i 24 h (y eventualmente la CE50i 48 h) y determina el rango de las concentraciones a ensayar en el ensayo definitivo de toxicidad; un ensayo definitivo (en los casos donde el valor aproximado proporcionado por el ensayo preliminar no es sufi- ciente), que permite calcular la CE50i 24 h y CE50i 48 h y determinar las concentraciones correspondientes al 0% y al 100% de inmovilizacin. Cuando el mtodo descrito en esta Norma Internacional se aplica a sustancias qumicas, se puede efectuar un ensa- yo lmite a 100 mg/l o a una concentracin ms baja, a la que la sustancia es soluble o est en dispersin estable en las condiciones de ensayo (vase 8.5). ISO 6341:1996- 6 - El anlisis de estas sustancias debera llevarse a cabo lo antes posible. Si estos anlisis muestran que, por cada con- centracin ensayada, la desviacin tpica de las concentraciones medidas durante el ensayo, que vara de forma aleatoria, no es mayor del 20% de la media, las concentraciones medias inhibitorias pueden calcularse a partir de las medidas, mejor que a partir de la concentraciones iniciales; se designan CE50 24 h (y, cuando proceda, CE50 48 h). 4 CONDICIONES DE ENSAYO La conservacin de las soluciones y la exposicin de los organismos descritas en esta Norma Internacional deben realizarse o bien en la oscuridad o en un ciclo da/noche de 16 h/8 h. El recinto de ensayo debe tener 20 C 2 C y estar exento de polvo o vapores txicos para la Daphnia magna. Las sustancias qumicas fotodegradables deben ensayarse en la oscuridad. 5 REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS 5.1 Organismo para el ensayo: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), al menos de tercera generacin, obtenida por partenognesis acclica en condiciones de crianza especificadas. Los animales utilizados en el ensayo, deben tener menos de 24 h de edad. Transferir las hembras portadoras a los recipientes que contienen el agua en disolucin fresca y recoger los neonatos liberados en las 24 h. La sensibilidad de las Daphnia magna a los txicos est influenciada por su edad y su procedencia; en con- secuencia, la edad y procedencia de las Daphnia magna utilizadas deber indicarse en el informe del ensayo. 5.2 Agua de dilucin Se disuelven cantidades conocidas de los reactivos de calidad analtica reconocida en agua subterrnea, en agua des- tilada o en agua desionizada de pureza equivalente, de una conductividad mxima de 10S/cm. El agua de dilucin preparada de este modo debe tener un pH de 7,8 0,2, un dureza total de 250 mg/l 25 mg/l (expresados en CaCO3), una relacin Ca/Mg prxima a 4:1 y una concentracin de oxgeno disuelto superior a 7 mg/l. Las aguas naturales de pH y con caractersticas de dureza similares al agua de dilucin, pueden utilizarse en los cultivos. A modo de ejemplo, la preparacin de un agua que responda a estas caractersticas se describe a continuacin: a) Se preparan las soluciones siguientes: 1 Solucin de cloruro de calcio Se disuelven 11,76 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl22H2O) en agua destilada o desionizada y se com- pleta hasta 1 litro. 2 Solucin de sulfato de magnesio Se disuelven 4,93 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO47H2O) en agua destilada o desionizada y se completa hasta 1 litro. 3 Solucin de bicarbonato sdico Se disuelven 2,59 g de bicarbonato sdico (NaHCO3) en agua destilada o desionizada y se completa hasta 1 litro. 4 Solucin de cloruro de potasio Se disuelven 0,23 g de cloruro de potasio (KCl) en agua destilada o desionizada y se completa hasta 1 litro. - 7 -ISO 6341:1996 b) Se mezclan 25 ml de cada una de estas cuatro soluciones 1 a 4 y se lleva el volumen total hasta 1 litro con agua destilada o desionizada. El agua de dilucin debe airearse hasta que la concentracin de oxgeno disuelto haya alcanzado el valor de satura- cin en el aire y hasta la estabilizacin del pH. Si es necesario, se ajusta al pH a 7,8 0,2 por adicin de solucin de hidrxido de sodio (NaOH) o de cido clorhdrico (HCl). El agua de dilucin preparada de este modo no debe airearse antes de su empleo. NOTA 1 Si el ensayo se realiza con un propsito que implique la utilizacin de un agua de dilucin con caractersticas diferentes de las des- critas anteriormente, se deberan mencionar en el informe del ensayo las principales caractersticas del agua sinttica de dilucin empleada. 5.3 Dicromato de potasio (K2 Cr2 07), de calidad analtica reconocida 6 APARATOS NECESARIOS Material corriente de laboratorio, y en particular el siguiente. 6.1 Aparato de medida del oxgeno disuelto 6.2 Recipientes para ensayo, en material qumicamente inerte y de capacidad suficiente (por ejemplo: tubos de ensayo o cubetas de precipitacin de vidrio). Antes de usarse, los recipientes de ensayo deben lavarse cuidadosamente y despus enjuagarse primero con agua destilada y despus con agua de dilucin (vase apartado 5.2). Al finalizar el ensayo, deben vaciarse y aclararse con agua para eliminar cualquier rastro de la solucin de ensayo, y despus secarse. 7 TRATAMIENTO Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS 7.1 Precauciones especiales para el muestreo y transporte de muestras del agua o de efluentes Para la recogida de muestras de aguas o de efluentes, se sigue el procedimiento especificado en la Norma ISO 5667-2. Los frascos deben estar completamente llenos para que no contengan aire. El ensayo de toxicidad debe realizarse tan pronto como sea posible y dentro de las 6 h siguientes a la recogida de la muestra. Si no puede realizarse en este intervalo de tiempo, la muestra puede refrigerarse (+ 4 C) en el lugar de la recogida. En este caso, la muestra debe analizarse dentro de las 48 h siguientes a su recogida. NOTA 2 Si no puede llevarse a cabo el ensayo en 48 h, la muestra puede congelarse para utilizarla dentro de los dos meses siguientes. 7.2 Preparacin de las soluciones de las sustancias de ensayo 7.2.1 Preparacin de las soluciones madre. Las soluciones madre de las sustancias a ensayar deben prepararse por disolucin de una cantidad conocida de la sustancia a ensayar en un volumen definido de agua de dilucin, (5.2) de agua desionizada o de agua destilada en un recipiente de vidrio. Deben prepararse en el momento en que van a emplearse, a menos que la estabilidad de la sustancia en solucin sea conocida por ser estable; en este caso, la solucin madre puede prepararse hasta 2 das antes del ensayo. ISO 6341:1996- 8 - Las soluciones madre de sustancias poco solubles en agua pueden solubilizarse o dispersarse directamente en el me- dio mediante medidas adecuadas, incluyendo dispositivos ultrasnicos o disolventes de baja toxicidad para la Daphnia magna. Deberan utilizarse disolventes slo cuando la CE50 sea mayor que la solubilidad de la sustancia ensayada. Si se usa un disolvente, la concentracin de ste en la solucin de ensayo final no debe sobrepasar 0,1 ml/l y dos series del ensayo testigo, una sin disolvente y la otra con la concentracin mxima en disolvente, deben realizarse en el ensayo. No se puede recomendar un procedimiento nico para la preparacin de las soluciones madre de sustancias con po- ca solubilidad en agua debido a la diferente naturaleza de las sustancias qumicas. 7.2.2 Preparacin de las soluciones de ensayo. Las soluciones de ensayo deben prepararse (vase 8.1) aadiendo las soluciones madre o muestras efluentes (vase apartado 7.2.1) al agua de dilucin (5.2) en cantidades especifica- das Cuando las soluciones madre se preparan en agua desionizada o destilada, se recomienda no aadir ms de 10 ml de solucin madre por litro de agua de dilucin. 8 PROCEDIMIENTO OPERATORIO 8.1 Generalidades En una serie de recipientes de ensayo (6.2),se introducen volmenes crecientes de la solucin de ensayo (7.2.2) o del efluente o muestra de agua (7.1) y se completa con el agua de dilucin (5.2), de manera que se obtengan las concentraciones deseadas para el ensayo. Se colocan las Daphnia magna en los recipientes para el ensayo de ma- nera que el nmero total de Daphnia magna por recipiente no sobrepase de 20, y que la densidad de Daphia magna por recipiente no sea superior a 5 Daphnia magna por 10 ml de solucin. Para cada serie de ensayos, se prepara un recipiente de control en el cual se introduce un volumen de agua de dilu- cin (5.2) igual al volumen de las soluciones de ensayo y el mismo nmero de Daphnia magna que las soluciones de ensayo. Si se emplea un disolvente para solubilizar o dispersar las sustancias, se prepara un segundo recipiente testigo con el agua de dilucin conteniendo el disolvente a la mxima concentracin utilizada (es decir, inferior a 0,1 ml/l). No deben alimentarse a los animales durante el ensayo y los recipientes deben mantenerse a una temperatura de 20 C 2 C. Al final del perodo de ensayo de 24 h (o si es necesario 48 h), se recuentan, en cada recipiente, las Daphnia mag- na todava mviles. Las Daphnia magna que son incapaces de desplazarse en los 15 s siguientes a una ligera agita- cin del recipiente deben considerarse como inmviles, aunque puedan mover sus antenas. Se determina el intervalo de concentracin que hace variar el porcentaje de inmovilizacin de 0% a 100% y se anotan las anomalas de comportamiento de las Daphnia magna. 8.2 Ensayo preliminar Este ensayo permite determinar la gama concentraciones sobre las cuales se lleva a cabo el ensayo definitivo. Con este propsito, se utiliza una sola serie de concentraciones (generalmente escogidas en progresin geomtrica) de la solucin patrn o del efluente. En el anexo A se da un ejemplo. - 9 -ISO 6341:1996 8.3 Ensayo definitivo Este ensayo permite la determinacin de los porcentajes de Daphnia magna inmovilizadas para las diferentes con- centraciones y la determinacin de la CE50i 24 h y, si es necesario, la CE50i 48 h. Se escoge el rango de concentraciones, de manera que se obtengan al menos tres porcentajes de inmovilizacin comprendidos entre 10% y 90%. En el anexo A se dan ejemplos para la eleccin de los rangos de concentracin. Para cada concentracin y cada testigo, se debe utilizar un mnimo de 20 Daphnia magna. Inmediatamente despus de haber contado las Daphnia magna inmovilizadas, se mide la concentracin del oxgeno disuelto (vanse las Normas ISO 5813 e ISO 5814) en los recipientes de ensayo que contienen la solucin con me- nor concentracin para la cual todas las Daphnia magna han sido inmovilizadas (si es necesario, puede reunirse en un solo recipiente el contenido de los recipientes correspondientes a esta concentracin, tomando las precauciones necesarias para no modificar la concentracin del oxgeno disuelto). 8.4 Verificacin de la sensibilidad de la Daphnia magna y de la conformidad con el procedimiento Se determina peridicamente la CE50i 24 h del dicromato de potasio (vase apartado 5.3) utilizando el agua de dilucin (5.2) para verificar la sensibilidad de las Daphnia magna. Se anota la CE50i 24 h en el informe del ensa- yo (teniendo en cuenta que slo representa la toxicidad de este compuesto y no es representativa de la sensibilidad de la Daphnia magna frente a otros productos). La verificacin se realiza como se describe en el apartado 8.3. Si la CE50i 24 h del dicromato de potasio no est comprendida