生物技术药物免疫毒性和免疫原性.ppt

生物技术药物的免疫毒性和免疫原性研究,Kaiyong LIU 华南农业大学,生物技术药物,生物技术药物 包括体内诊断、治疗与预防用途； 来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞 蛋白质、多肽及其衍生物、核酸 如细胞因子、生长因子、融合蛋白、酶、激素、单抗、载体等 特殊性 结构、生产工艺、保存条件、同源性、作用靶点明确等固有的特点,免疫毒性/免疫原性,免疫毒性 是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药物）或不相关（如部分抗肿瘤药物）。 免疫原性 指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质。,研究意义,意义重大：如 免疫抑制，感染，肿瘤 免疫增强，放大自身免疫反应或过敏反应。 免疫原性，是药物本身具有的性质，有免疫原性不一定导致毒性，但可以影响对药物毒性、毒代或药效的客观评价。 但在规范及指导原则方面，缺乏共识，实验方法也不统一,免疫毒性研究内容一,常规的免疫毒性指标包括： 白细胞总数及其分类计数 球蛋白和白/球比值 补体水平 淋巴器官/组织的大体解剖 胸腺和脾脏的器官重量 免疫病理：胸腺、脾脏、引流淋巴组织,免疫毒性研究内容二,额外的免疫毒性试验（additional studies），如 (1) 常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性，感染 (2) 受试品的结构，与已知免疫调节剂相似 (3) 药代动力学结果:原型药或代谢产物在免疫组织 蓄积 (4) 适应症:如用于抗HIV药物 (5) 药理作用：常对免疫系统有影响,常规的免疫毒性检测结果 引流淋巴组织检查,图 猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结,：对照组，：高剂量组,常规的免疫毒性检测 免疫抑制/增强,全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细胞变化等。 免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或组织细胞密度变化 血清免疫球蛋白变化 用药组感染发生率升高 用药组肿瘤发生率增多(除遗传毒性、激素效应或肝酶诱导外),额外的免疫毒性试验内容,免疫功能检测 如T细胞依赖的抗体反应、NK细胞活性、CTL活性、细胞因子表达、巨噬细胞/中性粒细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力研究） 免疫表型检测 依据免疫学理论和具体靶分子种类,额外的免疫毒性试验方案,增设卫星组、增加免疫学指标或改变给药方案等。 发育免疫毒性：在成年动物中发现免疫抑制作用后，需要评价发育免疫毒性作用，如观察母代暴露于药物后仔代的淋巴系统、血液系统、细胞因子等，两种以上功能检测等。不仅是免疫抑制！ 常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个体化,额外的免疫毒性试验方法,免疫功能检测,额外的免疫毒性试验方法,免疫功能检测,注：GPMT与人一致性约70%，LLNA约72%,额外的免疫毒性试验方法,免疫表型检测 常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例,免疫功能检测 分泌IFN细胞,图 猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特异性的分泌IFN的淋巴细胞数量,免疫细胞表型检测 CD22阳性比例,图 食蟹猴静脉注射SM03嵌合抗体后CD22标记阳性细胞率的变化,CD22阳性细胞比例（%）,免疫细胞表型检测 CD4/CD8比例,CD4/CD8比例,图 猕猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例,免疫毒性试验结果分析,统计学意义与生物学意义（尤其单一指标） 变化程度 与剂量/暴露关系 与拟用临床剂量的关系 疗程关系 涉及动物种属数量和受影响的终点 可能继发于其他因素 (e.g., stress,） 可能的细胞靶点和（或）作用机制 引起这些变化的剂量与产生其他毒性的剂量关系 可逆性,免疫毒性靶器官的分析线索,靶分子在免疫器官或组织的分布 受试品或其代谢产物的分布 相关指标的变化 常规免疫指标、细胞因子变化等。,免疫毒性机制推测,受体或药靶直接引起的毒性反应（on-target) 如干扰素引起骨髓抑制 受体或药靶介导的间接毒性反应 如rhIL-12能诱导干扰素的分泌 非特异机制 如rhTNK-tPA引起肝细胞剂量依赖性的脂肪变性。,免疫原性研究内容,免疫原性(immunogenicity) 指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen）。产生特异性抗体或致敏淋巴细胞能力。 影响因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子结构，蛋白质多糖核酸类脂 宿主因素、免疫方式,免疫原性研究意义,免疫原性影响重复给药毒性试验结果的分析：中和药物活性、改变药物的清除、半衰期和组织分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue distribution） 建立免疫分析方法，供临床试验应用,免疫原性研究内容,抗体检测方法学验证 免疫反应检测 抗体滴度、抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化、抗体的中和活性、。 抗体与药代/药效和安全关系的评价 同期的药效/药代（毒代）/毒性反应的变化、补体激活与否、免疫复合物在肝肾的沉积、是否需要终止给药、临床意义分析等,抗体检测方法,ELISA-桥法 包被药物，用标记的药物检测。 ELISA-直接法 包被药物，用标记抗体检测。 （缺点：包被时可能会掩盖或改变药物的表位，仅检测单一亚型，有种属特异性，多次洗涤时丢失低亲和力抗体，参考品与样本之间试剂可能不同）,抗体检测方法,间接法 包被单抗或生物素，再加药物。 放射免疫沉淀法（RIP） 液相法，中等或高通量水平 表面等离子体共振 液相法，不需结合物（酶标记抗体），能检测到不同亲和力的抗体和各亚型抗体 电化学发光法 液相法，可检测各种抗体亚型,抗体检测方法考察,方法学考察 灵敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗体检出 受试物干扰：如有文献报道，如血清中受试物浓度大于0.15g/ml，则难以检测到抗受试物抗体。一般从1：10开始稀释或对样品进行处理。长效? 精确度：利用阳性对照品重复测量 阴性对照血清一般需从15只动物或50人中抽取,免疫复合物在肝肾的沉积,：溶剂对照组猴肾组织,：重组葡激酶大剂量组肾组织,图 猕猴iv重组葡激酶周后肾组织的免疫组织化学染色,抗体检测结果描述,抗体滴度结果表示 数据呈非正态分布，取对数后达正态分布，需用几何均数表示 抗体检测结果 抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化,抗体中和活性检测,常用依赖细胞株 抗病毒致细胞病变（CPE） 克隆细胞株 靶基因检测等。 游离或与抗体结合的受试品对中和活检测的干扰（偶联抗体的琼脂糖凝胶珠吸附）,抗体中和活性的检测 CPE法,图 猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后血清对 HIV-1 HN 024的中和活性,抗体中和活性检测方法 靶基因表达,抗体产生对药效相关指标的影响,图 注射表达EPO基因裸质粒8周后贫血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的检测,抗体产生对药代的影响,临床上连续应用重组水蛭素5以上可使74%的患者产生抗水蛭素抗体（AHAb）。,抗体产生对药代的影响,0,4,8,13,17,21,0.01,0.1,1,10,TPO ( ng / mL）,-,),时间 (天 ),图 猴皮下连续注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO浓度(实测值和抗体滴度(, 血清稀释倍数的倒数）,抗体产生对毒性反应的影响,图 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IFN后白细胞计数、抗体滴度和血清中和活性,*,*,*,*,*,*,*,*,中和抗体产生对给药方案的意义,中和抗体影响了大多数动物的药理和（或）毒性反应，则可以考虑终止给药。 中和抗体水平，在体外能中和安全剂量达到的血药浓度的作用时，可以考虑终止给药。需结合药动学资料。,总 结,生物技术药物免疫毒性评价 重视，个体化原则，采用新方法 生物技术药物免疫原性评价 强调规范，分析与毒性反应等关系,CD28激动剂TGN1412的期临床试验事件,德国公司研制的抗CD28超级激动剂TGN1412（人源化单抗）用于治疗白血病等，在1期临床试验中，单次静脉注射12-16h，6例均出现严重不良反应（多器官衰竭）。,CD28激动剂TGN1412的期临床试验事件,研究发现注射受试品后很快导致前炎症因子释放（细胞因子风暴），心