炭疽采样与检测.ppt

炭疽采样与检测,了解炭疽病原,生物危害程度 国际：生物危险分类属于III类 中国：危害程度分类属于第二类 卫生部人间传染的病原微生物名录 炭疽芽胞杆菌特点 在自然界易形成芽胞 芽胞对外环境有较强抵抗力 被芽胞污染的环境消毒困难，易传播扩散,实验室防护级别,从现场标本中直接进行细菌分离培养、初步鉴定、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微镜检查等检测活动可在生物安全二级实验室中进行。 大量活菌操作和动物感染实验应在生物安全三级实验室中进行。,基层实验室一般仅做细菌检验分离，要求具有实验室、无菌室和生物安全柜，一般不做强毒菌动物感染和解剖，应有能用的高压灭菌设备和安全的污水消毒设施。 炭疽杆菌对含碘和含氯消毒剂敏感，酒精消毒效力差。,个人防护与环境保护,一、标本采集防护 病患标本采集时，应穿防护服或隔离衣，戴双层手套，必要时需要穿鞋套。 外层手套应按需要及时更换以免扩散污染。 采样后，标本管外及时消毒，采样部位应做好碘酒消毒处理以免扩散感染。,二、标本储存与运输 可疑带菌的标本在储存和运送至实验室的过程中应特别注意做好防护，应用 可加盖密封的双层容器包装（采过样的两个拭子放入无菌15ml尖底离心管，管外用1%次氯酸钠溶液擦拭消毒然后再放入50ml尖底离心管，马上运回实验室）。 标本采集和运输前应事先准备工作浓度的消毒液（1%次氯酸钠溶液），以及时处理意外发生的标本洒落。,三、医疗废弃物的处理 及时将隔离衣、手套等一次性和可重复使用的物品分别放入分类的高压袋，及时高压处理。 尖锐的物品要放置于专用的锐器盒里，及时高压处理。 压力0.12MPa，温度121，有可疑炭疽污染的物品时，需高压1h，若无炭疽污染的物品时，需高压30min。,标本类型,病患标本 血液 急性期和恢复期双份留取血清，检测抗体 皮损渗出液 分离病原、检测毒力基因、细菌核酸、玻片染色 痰液、鼻腔拭子、排泄物、脑脊液等 动物标本 腐烂尸体、动物产品、皮毛、骨头、脏器、干血块等。 环境标本 可疑污染土壤、污水、食物，可疑邮件粉末等,实际操作：实验室人员接到要 去现场采集标本任务后,1、向流病科人员了解该病例基本情况： 病人流行病学史，初步怀疑什么病 去什么地点采样（医院、家？） 病人目前临床症状，是否使用抗生素，用抗生素的时间和量，病人白细胞多少（细菌感染升高，病毒感染不升高） 2、考虑： 去现场采集什么样品，并进行相应采样准备工作。采样物品务必带全。,皮肤炭疽病例采集标本类型,一、疑似病例（尽可能在使用抗生素前采集） 1、皮肤病灶处样品（不放过散在瘀血点） 水疱渗出液：采样拭子蘸取或注射器抽取 焦痂表面：拭子稍用力反复涂抹 样品用途： A：玻片涂片(革兰氏染色查炭疽杆菌） B：涂血平板（炭疽杆菌分离培养） C：炭疽杆菌细菌DNA核酸检测,皮肤炭疽病例采集标本类型,2、静脉血 用途： A：抗体快速试剂检测 B：ELISA法测检测抗体 二、共同暴露着、密切接触者（一起生活、治疗、护理） 采集静脉血，测抗体。 若有皮肤症状（病灶），用拭子采样。,采样所需器具与耗材 (皮肤炭疽为例）,1、样品采集运送箱（出诊箱）2个 2、生物安全防护用品、消毒用品（足量、用出诊箱或黄袋子装）： 一次性防护服、乳胶手套、帽子、鞋套、防护眼镜、口罩、一次性中单、多个耐高压医疗废物袋 3、采样用品（放出诊箱里）： 无菌采样拭子、无菌生理盐水、剪刀、无菌15ml离心管、试管架、真空采血管、注射器、一次性静脉采血针（蝶形）、75%酒精、镊子、络合碘、 1%次氯酸钠（临去采样现场前稀释好，用大瓶装）、50ml离心管（样品管外层包装用）、无菌1.5mlEP管、显微镜载玻片和载玻片放置架、 血平板和接种环（如果在当地能进行初步培养的话可带）、压舌板、无菌小匙；采集环境标本时应使用宽口的容器； 4、用于盛放废弃利器的锐器盒（可用带盖铝饭盒或硬质塑料盒）； 5、用于装一次性物品的感染性材料耐高压医疗废物袋 6、标签、水笔、记号笔、胶带、采样登记表； 7、洗手器具（手消毒液等）或脱去手套后洗手的洗手液和擦手纸。,采集方法 病患标本,尽可能在使用抗生素前采集。 皮肤病灶处标本采3份以上，尽可能多采。 病例均采集急性期和恢复期血液标本各1份，即双份血清。急性期和恢复期采集时间间隔应在7天以上 急性期血清：发病7天内的血清（放宽条件14天内） 恢复期血清：发病14天后的血清,具体采集方法 病患标本,1、采样人员到现场后，首先拿出一次性中单铺在一处平整的桌面等地方，然后穿戴一次性衣服、口罩、帽子、双层手套、防护眼镜、鞋套等。 2、观察病灶部位。 3、打开出诊箱，拿出采样器材，按下述方法采样。,采集方法 病患标本 （2人一起合作采样）,疑似皮肤炭疽 水疱期未破损（易发现炭疽杆菌） 水疱较大时：无菌操作下（注射器）穿刺水疱，无菌棉签沾取水疱液，放在一个15ml离心管中，手持部分折去，每采2个拭子放在一个15ml离心管中，每个病例至少采集3管以上样品。然后用碘酒消毒处理以免细菌扩散 水疱较小时：用注射器先抽取无菌生理盐水，注射进水疱，再把水疱内生理盐水抽出来，放无菌离心管，再用无菌拭子沾取水疱处可能剩余液体，然后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。,采集方法 病患标本 （2人一起合作采样）,疑似皮肤炭疽 水疱期已破损 用无菌拭子沾取渗出液，每2个拭子放在一个15ml无菌离心管中，手持部分折去，盖盖，在管上标记编号等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。 结痂期（采黑色焦痂） 用无菌棉签蘸取生理盐水后稍用力反复涂抹焦痂表面，直到棉签头变成黑色。每2个拭子放在一个15ml无菌离心管中，手持部分折去，盖盖，在管上标记编号等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。 如果焦痂边缘有破损，也可用无菌棉签取焦痂下的组织，其他同上。,采集方法 病患标本 （2人一起合作采样）,血液标本 用无菌手续采集病例静脉血5ml到无菌真空采血管中。在管上标记编号等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。 注：1、以上病患处标本每个病例至少采集3管，最后管外用1%次氯酸钠消毒后放入采样箱。 2、血液标本采集后管外用1%次氯酸钠消毒后放入采样箱。 3、样品采集后尽快送到实验室，除血液标本外，其他带冰运送。,4、采样时产生的废弃物放在利器盒中带回实验室消毒。其他穿过、用过的一次性衣服等所有用过物品都放在耐高压医疗废物袋中带回实验室121 1h高压灭菌。 5、采焦痂样品要稍用力涂抹，病人不疼，因为感染炭疽杆菌时末梢神经受损。平时病灶处偶尔有些痒。 6、采样拭子用病毒采样拭子，一般棉签会影响核酸检测结果。 7、采样结束怎样消毒手？ 因为采样时带着双层手套，结束后脱去手套，常规洗手即可。,采集方法 密切接触者,采集血液：测抗体 若有皮肤破损（病灶），用拭子采样，同上面方法。,采集方法 动物相关,肉类 怀疑罹患炭疽的家畜已被宰杀 对商品肉类进行常规检查 毛皮或其他可疑污染物品 取小块，剪碎置无菌管内，加适量无菌生理盐水浸泡。 宰杀地土壤 在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本或圈舍土。,剪取小块肉类，特别应剪取肝脏、脾脏等富含血液以及含淋巴组织的标本,采集方法 外环境标本,一、污染土壤监测 过去炭疽死畜和死亡病例埋葬地点 近年有人畜间炭疽发生或死亡的区域（如草场） 分离出炭疽杆菌的土壤地点，消毒效果监测及评价 取表层土壤（10cm内）5份以上，每份500g左右，加水静置，经加热处理后用漂浮法培养。,二、污染水源 牲畜饮水处 污物浸洗液 注射器吸取水样约500ml，用抽滤法培养滤膜 。 三、空气采样：空气采样器采300L，抽滤后进行培养。 四、可疑粉末：无菌小勺取样于无菌管中，注意要在严格防护下小心取样，以免产生气溶胶。,炭疽标本采集需注意的事项,注意个人防护，需戴口罩，戴手套，穿鞋套，必要时穿防护服或隔离衣，眼罩等； 采集标本应在无菌操作下进行，标本管外及时消毒，应做好采样部位的消毒处理以免扩散污染。 应事先准备工作浓度的消毒液，标本应用可加盖密封的双层容器包装，采样后及时对容器外表面进行擦拭消毒； 标本运输中也应备有消毒液，以及时处理意外发生的标本洒落。 采样后及时将一次性的防护用品（防护服、手套等）和可重复使用的物品分别放入高压袋或器皿中，及时高压处理；,炭疽常用消毒液：含氯消毒剂，1%次氯酸钠。,使用高压灭菌器处理，当压力达到0.12MPa，温度达到121时，开始计时灭菌。有可疑炭疽污染的物品时，需高压1h。,炭疽菌株和样本的包装,卫生部可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部第45号令）,标本储存与运输,采集的标本应该放在可密封的采样管等容器中，并用双层包装以免在运输过程中发生洒落。 采样后应在标本容器上标记好采样时间、地点、类型及采样人员。 标本应尽早送检，若标本送达实验室的时间需超过1h，应在2-8储存，血标本可室温直接运输至实验室。 运输炭疽菌株或样本时应当有专人护送，护送人员不得少于两人。申请单位应当对护送人员进行相关的生物安全知识培训，并在护送过程中采取相应的防护措施。,实验室检测技术,直接镜检 病原菌分离 血清学实验 荧光定量PCR法,直接镜检,对疑似病例的皮肤病灶表面直接用载玻片按压蘸取渗出液，革兰氏染色，观察镜下是否有大量两端平齐呈串联状排列的革兰氏阳性大杆菌。 可作为临床诊断支持性实验依据。,直接涂片镜检,自己实用操作： 在生物安全柜中，拧开装有病灶涂抹物拭子的尖底管，用镊子夹住拭子杆，在玻片上涂片，干后在酒精灯火焰外焰上通过3次固定，进行革兰氏染色。 注：镊子随后高压消毒。,病原菌的分离,涂血平板： 在生物安全柜中，用镊子夹住病灶涂抹物拭子或疱疹液拭子直接接种血平板（一般用血平板，也可用营养琼脂平板），分3区或者4区划线，37培养16-18h，观察菌落形态。 挑取单个菌落于载玻片上进行革兰氏染色，镜下观察结果。 （镊子随后高压消毒）,炭疽杆菌的形态-培养,普通琼脂： 灰白色，表面粗糙，无光泽，边缘不整齐。,炭疽杆菌的形态-培养,普通琼脂： 灰白色，表面粗糙，无光泽，边缘不整齐。,ICDC, China CDC,炭疽杆菌的形态-培养,血琼脂： 灰白色，表面粗糙，无光泽，边缘不整齐， 不溶血。,炭疽杆菌的形态-培养,炭疽 蜡样,炭疽杆菌的形态-培养,1010显微镜下，卷发状，中央暗褐色，边缘有菌丝射出,炭疽杆菌G染色-繁殖体,ICDC, China CDC,显微镜下形态,革兰染色 孔雀绿沙黄芽胞染色,炭疽芽胞杆菌的生化特性 （不易鉴定，不典型）,炭疽芽胞杆菌的鉴定（可行）,血清学实验,胶体金法检测抗体（不分IgG和IgM ） 优点：快速，简便，可迅速获得结果，特异性较好。 缺点：敏感性一般，有漏检的可能。 酶联免疫吸附试验 优点：敏感性高，特异性好，可定量检测，是确诊的依据之一。 缺点：耗时长，实验场所有设备要求。,胶体金法,按照说明书要求用生理盐水稀释血清，直接滴加胶体金试纸条，一定时间后观察结果。,酶联免疫吸附试验操作程序 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),原理（间接性ELISA）：,显色,酶联免疫吸附实验（ELISA）用液 1） ELISA包被液（0.01M PBS，pH7.4）： 2）0.1M PBS（10PBS，pH7.4）： 3） 血清稀释液（MP Diluent）： 4） ELISA稀释液（ELISA Diluent）： 5） 洗涤液：0.01M PBS溶液加0.5%的Tween-20。 6） 显色液：TMB，即用型。 7） 终止液：0.5M H2SO4。,酶联免疫吸附实验（ELISA）操作方法 1. 包被抗原：将PA用0.01M PBS稀释至1.0g/ml，酶标板所用各反应孔加入100l，置4包被过夜，不用封闭，7天内使用。临用前用洗涤液洗涤3次，每次3min。 2. 待检血清反应：标准血清以及待检血清首先用血清稀释液稀释至合适的起始浓度，依照平板布局（详见图4-1）将稀释好的血清加入平板A排（100l/孔），进行倍比稀释。血清标本最低起始稀释度为1:50，使用两孔平行检测，每孔100l。每板做标准参考血清，同时做试剂（空白）、阳性血清和阴性血清对照孔，各3个平行检测。 若用做初筛试验则不必做倍比稀释，可直接按1:50稀释后进行检测。 酶标板置37湿盒中孵育60min。甩干孔内溶液，每孔洗涤3次，每次3min。,图4-1 ELISA实验平板布局 注:RC=空白对照，S1-S7=标准参考血清浓度1-7， T#=待检血清#， QC1=高浓度阳性对照血清，QC2=低浓度阳性对照血清， N1= 阴性血清,3. 酶标抗体反应 于各反应孔中加入工作浓度（1:10000）辣根过氧化酶标记抗人IgG 100l，置37湿盒孵育60min。再用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。 4. 显色反应 于各反应孔中加入显色液（TMB）100l，置暗处30min。 5. 终止显色 每孔加入显色终止液100l，终止显色。 6. 读取OD值 终止显色后30min内，在波长450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。,结果判定 OD值大于阴性血清2.5倍的血清，定义为阳性，对应的最大稀释度，定义为阳性滴度。,阴性对照,尽量采集病人急性期和恢复期双份血清。 急性期血清是指发病7天内的血清，特殊情况下可放宽至14天内；恢复期血清是指发病14天后的血清。 急性期血清和恢复期血清采集的时间间隔应在7天以上。,荧光定量PCR法,核酸提取和模板制备原理 炭疽芽胞杆菌或含炭疽芽胞杆菌的样本通过物理或化学作用，破坏细菌膜， 消除菌体蛋白成分，在一定缓冲体系（Tris）和核酸保护剂（EDTA）等体系下，提取炭疽芽胞杆菌染色体。试剂盒法提取核酸各步骤主要包括：菌体裂解、消除蛋白成分、DNA与膜结合、冲洗、DNA纯化析出等。,荧光定量PCR法,核酸提取：平板培养物或将装有2个病灶采样拭子的15m尖底管里加入少量（12ml）生理盐水振荡（震荡时封口膜封住管盖处）10-15秒，吸取全部液体（拭子上样本和生理盐水的混悬液）到2mlEP管中，用封口膜封住管盖处，标记，7000-8000转离心10分钟，弃去上清液（自然倒掉），加入适量含有溶菌酶的缓冲液，混悬沉淀，56水浴30min以上，进行下一步核酸的提取。 注：除了震荡和离心，其余操作在生物安全柜内进行。,荧光定量PCR标准操作程序,Real-time PCR 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，从而实现对未知模板进行定量分析。,系统组成 荧光定量PCR仪 电脑及分析软件 试剂及耗材,Real-time PCR 和 常规PCR区别 实时检测 敏感性高 需要样品少 特异性高 精确定量,Real-time PCR的引物及探针,稀释方法同常规PCR引物，注意引物名称和配对,注：按以上组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行），也可根据所使用的试剂情况对反应体系进行调整。,Real-time PCR反应体系,反应条件：一般使用两步法进行PCR扩增。 Stage1（预变性）：9530秒，1Cycle； Stage2（PCR反应）：955秒，5720秒，45Cycle。,不同的荧光定量PCR扩增仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对PCR反应的程序进行适当调整，以得到最佳的实验结果。,Real-time PCR反应条件,荧光定量PCR防污染注意事项,由于荧光定量PCR极其灵敏， 微量的污染就可能造成扩增体系的失败， 而且污染极难去除， 因此在荧光定量PCR操作中应时刻避免可能的污染，操作要点如下： 1.分区操作, 配制反应体系、加阳性标准品和疑似样品核酸、PCR扩增需在不同实验室空间进行。 2.试剂专用，并以小份储存。配制溶液时，应使用没有接触过本实验室使用的DNA的新离心管和枪头。溶液使用过后即丢弃。 3.普通PCR要避免在上述区域内操作，尤其是电泳环节可能造成大量DNA外溢的操作。PCR扩增后，反应管禁止开盖，PCR扩增样品禁止带回实验操作区。,4. 在配制反应体系、加阳性对照模版、加待测样品等实验环节时，更换白衣、手套、戴口罩、帽子等可有效减少污染。 5.实验操作要移液器专用。用于加样和配体系的移液器要分开。 6.如果使用超净台加阳性模板或样品时不要开风机。 7.一些可能造成污染的危险操作，如阳性标准品的制备、包含有目标模板的阳性标准品的克隆、电泳等操作、稀释阳性标准品、阳性对照模板的制备都应事先在其他实验室操作完成， 上述实验操作使用的装备在荧光定量PCR操作中也要避免使用。,8.配体系时，0.2ml排管和PCR管操作建议放置在干净的枪头盒（应在冰上）上操作。 9.试验过程中注意用洁净的管盖及时盖住加入模板或阳性品的反应管，在大量试验和用96孔板加样实验时尤其要注意。 10. 离心机应专用。 11.打开装有反应物的离心管之前，先在离心机上短暂离心，使液体沉积至管底，减少污染手套和移液器的可能性。不同样品操作之间，怀疑有可能污染的环节要更换手套。 12.试剂配制用专用去RNA酶的水。实验样品和试剂要专属放置于特定冰箱层。 13.模板加样顺序为， 阴性对照， 疑似样品， 阳性对照。 14.实验结束后， 桌面酒精擦拭，紫外260 nm灯照射2h， 实验废弃物及时清除。,手足口病标本采集,手足口病介绍 手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病,以婴幼儿发病为主。,大多数患者症状较轻，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。 部分患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等,个别重症患儿病情进展快,易发生死亡。 少年儿童和成人感染后多不发病，为隐性感染者，但能够传播病毒。 2008年，卫生部已把手足口病纳入法定传染病丙类管理。,样本采集标本的种类、保存和运输,医疗机构负责样本采集，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。 所有重症和死亡病例均要采集标本，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。聚集性病例至少要采集2例病例标本开展病原学检测。,（一）粪便标本：采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便盒内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4暂存12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。 （二）咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。,（三）肛拭子标本。 采集病人发病3日内的肛