基因工程的操作程序培训课件.ppt

复习回顾,1、基因工程又称为？基因工程的原理是? 2、基因工程中用到的工具中，“分子手术刀”是？来源是？其作用是？体现了酶的什么特性？作用部位是什么键？ 3、限制酶切割之后的结果是产生？从中轴线两侧切割得到的是什么末端？从中轴线处切开呢？ 4、获得目的基因需要切几个切口？产生几个黏性末端？切割质粒呢？ 5、“分子缝合针”是？根据什么分为两大类？哪两大类？这两类酶的区别是？ 6、DNA连接酶连接的是？DNA聚合酶连接的是？ 7、DNA连接酶作用于什么键？,8、载体主要有哪几类？其中，最常用的是？它的本质是？ 9、载体必须具备的四个条件是？ 10、写出限制酶切割后的黏性末端。,基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,问题1,一：目的基因的获取,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1.目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,目的基因指的是：,？,也可以是具有调控作用的因子,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、人工合成目的基因,反转录法,化学合成法,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库概念,2.基因文库类型,（包含一种生物的所有基因）,（包含一种生物的一部分基因）,(一)从基因文库中获取目的基因,3.基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,4.cDNA文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）,总结,1、概念：PCR全称为_，是一项在生 物_复制_的核酸合成技术,3、条件：,2、原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA双链复制,(二)利用PCR技术扩增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脱氧核苷酸),引物（一小段单链DNA）,耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）,温度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、结果 ：,5、扩增形式：,指数形式（2n）,在短时间内大量扩增目的基因,7、过程：,a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作 用下，_断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示,（三）人工合成目的基因,反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,化学合成法,DNA合成仪,推测,推测,合成,前提：基因比较小、核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,问题4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,获取目的基因的三种方法应用,1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用_,PCR技术扩增,化学合成法,从基因文库获取的方法,复习回顾,1、基因工程的基本操作程序的四个步骤是？核心是？ 2、目的基因指的是什么基因？ 3、获取目的基因常用的三种方法是？其中人工合成法又包括哪两种? 4、基因文库包括哪两类？ 5、PCR的原理是？PCR全称是？PCR扩增过程中的解旋方式是？PCR需要的条件有？ 6、基因表达载体的构建的目的是？ 7、一个基因表达载体的组成包括哪几部分？ 8、标记基因的作用是？ 9、启动子，终止子的位置，作用？起始密码子，终止密码子呢？,二：基因表达载体的构建基因工程的核心,1,目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录（与终止密码子区别） 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,3.基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 四个黏性末端,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,三、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因导入受体细胞的方法,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,基因枪法,（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞, 特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉（我国）,（4）、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？,全能性受限制,（5）、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞优点： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 常用菌：大肠杆菌 常用法：Ca2+处理获得感受态细胞 （改变细胞壁的通透性） 过程：,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体 与感受态 细胞混合,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，目的基因-目的基因类型,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,问题4,问题5,检查是否成功,分子 水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子杂交、DNA探针,分子杂交、DNA探针,抗原-抗体杂交、抗体,四、目的基因的检测与鉴定,方法：,接种实验,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,（4）除上述分子检测外，有时还需进行 个体生物学水平的鉴定：如抗性特性,检查是否成功,分子 水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子杂交、DNA探针,分子杂交、DNA探针,抗原-抗体杂交、抗体,四、目的基因的检测与鉴定,方法：,接种实验,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体