基因工程的基本操作程序培训课程(ppt 6).ppt

1.2 基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、第一步：目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,阅读教材P8-11,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因等。,（1）、基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,1、从基因文库中获取目的基因,非编码区,非编码区,编码区,外显子,内含子,原核和真核细胞的基因的结构,启动子,原核：,真核：,终止子,RNA聚合酶结合位点,原核与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（2）、基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存, cDNA文库的构建-反转录法：,真核生物的基因用反转录法得到的cDNA与原基因相同吗？两种基因文库有区别吗？,思考？,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（3）、构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（4）、从基因文库中得到目的基因的方法、,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（ ） A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,C,2、利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。, 原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,PCR技术,原理： 原料： 优点： 过程：,PCR扩增仪,DNA复制,以_方式扩增， 在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,（热）变性,复性,延伸,具体过程：,a、热变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）： 在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d、重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成。,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,课堂小结,反转录法,化学合成法,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,课堂练习,3、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个。,A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1、过程:,第二步：基因表达载体的构建,2、基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,3、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 真核生物：酵母菌和动植物细胞,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,第三步：将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程。,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农秆菌 转化法,特点:,能感染双子叶植物,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,常用于单子叶植物的转化方法,（3）花粉管通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理法,微生物作受体细胞原因： 繁殖快（最主要）、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理法,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因主要是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基 因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,接种实验,抗原抗体杂交,核酸（DNA-RNA）分子杂交,DNA分子杂交,第四步：目的基因的检测与鉴定,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质 A B C D,C,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,获取目的基因,构建基因表达载体,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,不能,皮肤细胞中胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA,逆转录,解旋,(4)若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则过程连续进行4次，至少需提供胸腺嘧啶_个。 (5)在利用A、B获得C的过程中，必须用_切割A和B，使它们产生_，再加入_才可形成C。 (6)为使过程更易进行，可用_(药剂)处理D。,15(a-b),同种限制性核酸内切酶,相同的黏性末端,DNA连接酶,Ca2+,将 基因与 等调控组件重组在一起，通过 等方法，导入哺乳动物的 中，将 其 送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。,乳腺生物反应器,乳腺生物反应器的优点：,药物蛋白,乳腺蛋白基因的启动子,显微注射,受精卵,产量高；质量好；成本低；易提取。,继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答： （1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。 （2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入_中，原因是_。 （3）通常采用( )技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。 （4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的 ( )细胞中特异表达。尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：处于不同发育时期的_动物均可生产药物。,显微注射法,受精卵,全能性高，外源基因可在相应组织细胞中表达,DNA分子杂交,膀胱上皮,雌雄,限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是 A、G与A之间的键 B、G与C之间的键 C、A与T之间的键 D、磷酸与脱氧核糖之间的键,利用基因工程生产蛋白质药物的方法之一是将人的基因转入动物体内，再饲养这些转基因动物，从动物乳汁或尿液中提取药物。这一过程不会涉及 A、DNA按照碱基互补配对原则自我复制 B、DNA以其一条链为模板合成mRNA C、RNA以自身为模板自我复制 D、按照mRNA密码子的排列顺序合成蛋白质,采用基因工程的方法培养抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（ ） 将毒素蛋白注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌，用该细菌感染棉花体细胞，再进行组织培养 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，注射到棉花子房，并进入受精卵 A. B. C. D.,c,利用细菌大量生产人类胰岛素，下列叙述错误的是（ ） A.用适当的酶对运载体与人类胰岛素基因进行切割与粘合 B.用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组 DNA 导入受体细菌 C.通常通过检测目的基因产物来检验重组 DNA 是否已导入受体细菌 D.重组 DNA 必须能在受体细菌内进行复制与转录，并合成人类胰岛素,c,1987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明：（ ） 萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相同 萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 烟草植物体内合成了萤光素 萤火虫和烟草植物合成蛋白质的方式基本相同 A和 B和 C和 D,D,我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是（ ） A抗虫基因的提取和运输都需要专用的工具和运载体 B重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的,下列哪项不属于通过基因工程培育成功的实例 ( ) A通过杂交实验培育出既抗倒伏又抗稻瘟病的水稻植株 B在马铃薯中引入细菌、病毒基因，防止克罗拉多马铃薯虫和马铃薯病毒 C把某些重组DNA转移到细菌中，培育出可以清除石油污染的假单胞菌 D在番茄中引入鱼、细菌、病毒基因，使皮增厚，有利于储藏、保鲜、防冻、延缓成熟，且果实软、便于做汤 下列设想中，从生物技术的原理看，不能实现的是 A用基因工程技术获得SARS疫苗 B用细胞融合技术制备抗HIV的抗体 C用发酵工程技术制造超级工程菌 D用克隆技术快速培育红豆彬苗,下列技术中，依据DNA分子杂交原理的是 用DNA分子探针诊断疾病 B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的杂交 快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量 目的基因与运载体结合，形成重组DNA分子 A B C D,“超级细菌”是指把三种假单胞杆菌中能分解不同烃类化合物的基因，同时移植到另一个假单胞杆菌细胞内，使之具有能分解四种烃类化合物的功能。请判断培育这一新物种的技术属于 A基因工程 B细胞工程 C酶工程 D发酵工程,多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（ ） A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现 B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,回答:为什么要进行蛋白质工程?,一、蛋白质工程崛起的缘由,这些蛋白质只是适应生物自身的需要，但不一定完全符合人类生产和生活需要，所以需要加以改造。,在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。,基因工程的不足：,二、蛋白质工程的基本原理,根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。,1、目标：,2、原理：,改造基因（基因修饰或基因合成）,(对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？),. 途径:,预期的蛋白质功能,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到并合成相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,蛋白质 三维结构,氨基酸序 列多肽链,基因 DNA,预期功能,DNA合成,分子设计,mRNA,生物功能,转录,翻译,折叠,图1-29蛋白质工程流程图（思路？）,推测,目的基因,预期蛋白质功能,中心法则的逆推,获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 目的基因的检测与表达,预期蛋白质功能 设计蛋白质结构 推测氨基酸序列 推测核苷酸序列 合成DNA,定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生物类型或生物产品,定向改造或生产人类所需的蛋白质,生产自然界中已有的蛋白质,蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因的修饰或基因的合成。,生产自然界没有的蛋白质,中心法则,1 、关于生物体内存在的天然蛋白质，下列说法不正确的是（ ） A是生物在长期进化过程中形成的 B它们的结构和功能符合特定物种生存的需要 C构成天然蛋白质的氨基酸目前发现的有20种 D一定完全符合人类生产和生活的需要,课堂练习,D,2、蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是 氨基酸结构 B蛋白质空间结构 C肽链结构 D基因结构,3、下列关于蛋白质工程的说法错误的是 A蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类的需要 B蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分