杆状病毒表达系统PPT参考课件.ppt

杆状病毒表达系统,1,杆状病毒简介,杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90180 Kb之间。模式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）. 核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(budded virus, BV) ，另一种则为包涵体病毒(occluded virus, OV)。,budded virus,occluded virus,2,3,杆状病毒生活周期,芽出病毒： 可以通过细胞-细胞间感染进行传播。 包涵体病毒： 释放到环境中后，通过昆虫摄食进行传播。如果仅用于感染昆虫细胞系，包涵体形成相关的基因都不是必需的。,4,杆状病毒基因表达的不同表达时相,立即早期 延迟早期 晚期 极晚期：该时相表达的蛋白（polyhedrin and p10）与包涵体形成相关，并且表达量极高。生物工程中可以利用这两个蛋白的启动子表达外源蛋白。,5,杆状病毒表达载体系统,1981年L. K. Miller根据AcMNPV分子生物学性质及现代分子生物学技术，从理论上阐述了杆状病毒作为载体表达外源基因的可行性。 1983年G. E. Smith等成功地利用AcMNPV作为载体在Sf细胞中表达了人-干扰素基因，完成了从理论到实践的飞跃。,6,G. E. Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基因）克隆到pUC8质粒上，然后把人-干扰素基因克隆到BamHI位点。 用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。 得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。 用重组病毒感染Sf细胞，得到-干扰素。,7,解决重组效率太低的问题,1990年P. A. Kitts把一个Bsu36I位点引入到多角体基因附近。用Bsu36I线性化的AcMNPV后，重组效率提高15-150倍，30%的空斑是阳性克隆。 1993年P. A. Kitts把两个Bsu36I位点一起引入，结果使重组效率达到90%，但还是需要空斑筛选（多角体，蓝白斑）。,8,直接通过病毒基因组DNA与转移载体（Transfer vector）重组示意图,9,构建Bacmid,1993年V. A. Luckow用miniF-Kan替换了多角体polyhedrin基因，构建了能在昆虫细胞和大肠杆菌之间穿梭的杆状病毒重组DNA，命名为Bacmid。该名称取自Baculovirus和plasmid。,J Virol. 1993 Aug;67(8):4566-79. Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO.,10,Bacmid polyhedrin位点附近序列细节： 目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。,11,获得重组病毒的方式,转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：,12,同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：,13,“转座”和“同源重组”目前都在使用中。 “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 这两种方式与外源基因的表达量无关。,14,几种获得重组病毒过程的对比,15,杆状病毒表达系统的优化,启动子、Kozak序列和UTR的优化改造。 虽然p10或polyhedrin启动子已经是强启动子，但通过改变上下游相关序列依旧能极大地提高外源基因的产量：,PLoS ONE 2014 9(5): e96562,16,敲除影响外源基因表达/非必需的病毒基因。 比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/Cath）有助于分泌蛋白的表达：,S.A. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113118,17,敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：,Cell Biol Toxicol (2010) 26:5768,18,糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的糖基化更像哺乳动物细胞：,19,抗凋亡Bacmid 将靶向昆虫凋亡效应蛋白Caspase的小RNA序列克隆到Bacmid上，使病毒感染的昆虫细胞抗凋亡，从而提高外源基因的产量：,Zhang et al. BMC Biotechnology (2018) 18:24,20,宿主细胞,Spodoptera frugiperda 细胞系 常用的有Sf9、Sf21细胞系 适用于转染后获得重组病毒 适用于蛋白表达 Trichoplusia ni 细胞系 商业化的High Five细胞系 不适用于转染后获得重组病毒 适用于蛋白表达，产量高于Sf细胞,21,总结,杆状病毒表达载体系统具有如下优点： 快速高产 具备翻译后修饰系统 生物安全性好 表达的蛋白能正确折叠 允许用于人类医学 杆状病毒表达载体系统的缺点： 它是个瞬时表达系统 产量远低于原核系统 糖基化修饰还不理想,22,无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒