特殊毒性试验

致癌毒性试验,肿瘤(tumor，neoplasm) ：有分裂潜能的细胞受致癌因素作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物,良性肿瘤：呈膨胀生长，与周围组织有明显的界限，多有包膜，它们生长常有“自限性”，对机体破坏较小,恶性肿瘤：癌和肉瘤,癌(carcinoma)：由上皮细胞来源的恶性肿瘤,肉瘤(sarcoma)：由间质细胞来源的恶性肿瘤,凡能引起动物和人类肿瘤、增加其发病率或死亡率的化合物,化学致癌物 (chemical carcinogen),化学致癌物在体内引起肿瘤的过程,化学致癌作用 (chemical carcinogenesis),第一节 化学致癌的机制,前致癌物,一、与致癌作用有关的代谢,近致癌物,终致癌物,代谢酶,代谢酶,多态性,多态性,不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其代谢产物才具致癌作用的化合物,前致癌物经代谢活化过程形成一种或一系列中间代谢产物，必须经进一步代谢活化，才能形成终致癌物,前致癌物 (precarcinogen),近致癌物 (proximate carcinogen),直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所形成的具有致癌作用的代谢物的统称,终致癌物 (ultimate carcinogen),二、化学致癌作用的分子机制,（一）DNA加合物,有致癌活性的终致癌物，含有亲电子结构基团的化合物，它能与细胞靶分子发生共价结合，形成加合物使这些生物大分子烷基化，导致DNA的突变,接触环境致癌物的标志,（二）DNA修复与化学致癌,正确修复，使机体内受损的DNA完全回复原有的结构和功能,错误修复，经修复的DNA部分仍可能在结构和功能上有缺陷,在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在基因，是化学致癌物作用的主要靶分子，在细胞癌变过程中起着关键作用,1癌基因 (oncogene),（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因,是一类被激活的基因，所指导合成的蛋白质能够促成细胞恶性表型的形成,机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息。正常情况下它呈静止状态，对细胞无害且具有重要生物学功能（调控细胞生长分化，促进细胞分裂、增殖等） 原癌基因在进化过程中高度保守,原癌基因 (proto-oncogene),当发生突变、缺失、病毒整合、染色体易位、基因扩增或促长剂插入时，原癌基因发生改变，失去正常的调控细胞生长和分化功能，使细胞发生恶性转化。发生恶性转化的原癌基因即是癌基因,化学、物理或生物等致癌因素作用于细胞后，引起原癌基因突变使之激活，转变成癌基因后才会导致细胞癌变,正常细胞分裂生长的负性调节因子，其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂活性，或称为肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)、肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene) 抑癌基因对细胞的生长、增殖和分化起负调节作用，即抑癌作用,2抑癌基因 (anti-oncogene),抑癌基因正常时可抑制肿瘤细胞的肿瘤性状的表达。当其自身不能表达或其产物去活化才允许肿瘤性状的表达,正常细胞转化为肿瘤细胞最少涉及两类基因的遗传学改变，即癌基因和抑癌基因的改变,（四）基因表达调控异常与肿瘤发生,基因学说：癌变是由于基因的改变 基因外学说：基因表达调控失常 理论统一,三、化学致癌过程,引发阶段 (initiation) 促长阶段 (promotion) 进展阶段 (progression),1引发阶段 / 启动阶段,致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细胞发生永久性、不可逆的遗传性改变,突变细胞（启动细胞，initiated cell）,引发剂（启动剂，initiator）,具有引发作用的化学物质,促进引发形成肿瘤细胞分裂生长的作用阶段,2促长阶段,引发物作用之后，促癌物长期、慢性作用 引发物单独作用一般不会引起肿瘤 只有促癌物的慢性作用不会引起肿瘤 引发物与促长物的作用有先后次序 引发作用不可逆，促长在早期可逆,具有促长作用的化学物质，称为促长剂 (promotor),在促进之中或之后，细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为遗传不稳定性增加和恶性变化，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出肿瘤的特征，如生长速度、侵袭性、转移能力及生化、免疫性能改变,3进展阶段,分化 程度 高 低,表皮干细胞的分化,图8-1 多阶段致癌理论图解,部分致癌物用目前常用致突变试验不能检出其致突变性,四、非遗传毒性致癌机制,常见的非遗传毒性致癌物：石棉、激素、免疫抑制剂、多氯联苯等,细胞间隙连接通讯 （gap junction intracellular communication，GJIC） 信号传导系统 纺锤丝系统 DNA修复系统 基因表达调控系统,非遗传毒性致癌机制,第二节 化学致癌物的分类,组1，对人类是致癌物，87种； 组2，对人类是很可能或可能致癌物 组2A，对人类很可能是致癌物，63种； 组2B，对人类是可能致癌物，234种； 组3，现有证据不能对人类致癌性进行分类，493种； 组4，对人类可能是非致癌物，1种,化学致癌物的分类,1遗传毒性致癌物,与DNA共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质 占化学致癌物的大多数 可利用遗传毒理学试验来检测,（genotoxic carcinogens）,二、根据致癌物作用机制的分类,直接致癌物（direct careinogens）：在体内不需要经过代谢活化即可致癌,间接致癌物（indirect careinogens）：在体内经代谢转化，其产物具致癌作用,无机致癌物：亲电子剂或通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变,2非遗传毒性致癌物,不作用于机体遗传物质的化学致癌物,（epigenotoxic carcinogens）,(1) 促长剂,本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌,佛波酯 (TPA及其衍生物)、苯巴比妥、二丁基羟基甲苯 (BHT)、1,8,9-蒽三醇、DDT、Alkanes及胆盐,(2) 内分泌调控剂,(3) 免疫抑制剂,主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲,主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。如嘌呤同型物,(4) 细胞毒剂,可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展。如次氮基三乙酸、氯仿,(5) 过氧化物酶体增殖剂,可导致细胞内氧自由基过量生成。如祛脂乙酯、邻苯二甲酸乙基己酯,(6) 固态物质,物理状态是关键性因素，可能涉及细胞毒性。如塑料、石棉,3. 未分类,二恶烷、美舍吡伦,助致癌物（cocarcinogens）：不具有引发和促长作用，但可以促进引发作用和增强促长作用，即能促进或增强全部致癌过程 。如乙醇、二氧化硫,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,化学致癌物的判别,人群流行病学调查：两项以上由不同研究者在不同地点、不同对象中以不同调查方法获得的结论相符的证据；,动物实验证据：两项按现行常规设计进行，符合GLP（good laboratory practice），在不同物种动物中所得结果一致的动物致癌物鉴定资料。,化学致癌物的判别,定性判别：受试物能否致癌； 定量判别：剂量-反应关系分析,致癌物判别方法,短期试验； 动物致癌试验； 人类流行病学调查,一、短期试验,依据是致突变性与致癌性相联系,（一）致突变试验,对致癌物的筛选需一组致突变试验，最好每一遗传学终点均有一个试验,若一项阳性，即可认为该受试物为致突变物，因而就可能是遗传毒性致癌物,国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类,DNA完整性的改变 DNA重排或交换 DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变,（二）细胞转化试验,受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程,观察内容：生长自控能力、细胞形态、细胞生长能力、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等,应用于细胞转化试验的细胞,原代细胞：叙利亚仓鼠胚胎细胞 (SHE细胞)、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等 细胞系：BALB/C-3T3，C3H10T1/2和BHK-21 病毒感染细胞：RLV/RE细胞(劳舍尔白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞)和SA7/SHE细胞 (猿猴腺病毒感染的SHE细胞),恶性变的细胞表现,细胞偏大，且大小不等 核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚，核仁增生而肥大 核仁核胞浆因RNA增多而偏酸性，呈嗜碱性染色而偏蓝 多见核分裂现象 接触抑制消失 生长表型的改变,一种有限的动物试验（limited in vivo bioassay）。它是在有限的短时间内完成而不是终生，其观察的靶器官也限定为一个而不是全部器官和组织,（三）哺乳动物短期致癌试验,常用的哺乳动物短期致癌试验,小鼠肺肿瘤诱发试验 小鼠皮肤肿瘤诱发试验 雌性大鼠乳腺癌诱发试验 大鼠肝转变灶试验,在给予受试物后，多次持续给予促长剂,阳性结果：与长期动物致癌试验相当。由于试验期较短，又未检查其他器官和系统，特别是皮肤肿瘤和乳腺癌的诱发试验似乎仅适用于较小范围的化学物质 阴性结果：意义较差,(一) 动物选择,二、哺乳动物长期致癌试验,易感性是选择动物最重要依据,物种：特定靶器官 品系： 年龄：刚断乳 性别：雌雄各半 数量：各50只,（二）剂量设计,一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组。3个染毒剂量组包括无作用剂量组、阈剂量组、发生肿瘤的剂量组（此为最高剂量组），以求出明确的剂量反应关系,原则上试验期限要求长期或终生。致癌试验通常与慢性毒性试验结合起来进行,（三）试验期限与染毒时间,小鼠最少1.5年 大鼠2年,致癌试验常用的指标,1肿瘤发生率,（四）结果的观察、分析和评定,3潜伏期,2多发性,对于阴性结果的认定应非常慎重 两个物种，两种性别，至少三个剂量水平且其中一个接近最大耐受量 每组有效动物数至少50只（动物数量与其自发肿瘤率成正比）,注意事项,三、人群流行病学调查,动物致癌试验，根据阳性结果检出潜在的人类致癌物,描述流行病学调查或临床观察发现怀疑人类致癌物,病例-对照研究,队列研究,四、致癌作用模型,转基因动物 (transgenic animal),借助基因工程技术将确定的外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色体上，在其基因组内稳定地整合经导入的外源基因，并能遗传给后代的一类动物,基因敲除小鼠,将小鼠基因组中特定内源基因定点突变的小鼠,1肿瘤演进模型,引起肿瘤的小鼠，可建立在某一基因的突变与导致肿瘤的细胞内变化间的直接因果性联系的试验模型。转基因小鼠