维生素类药物的分析 (3)

,维生素类药物的分析,The Analysis of Vitamines,基本内容 酯溶性：维生素A,D,E； 水溶性：B族维生素,维生素C结构与性质、鉴别试验、含量测定。,掌握维生素A、B1和C的化学结构与分析方法的关系；维生素A的紫外分光光度法和维生素C的碘量法。 熟悉维生素C的2,6-二氯靛酚滴定法。 了解维生素D和E的化学结构与分析方法的关系。,基本要求,维生素 是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。 人体不能合成维生素。 不同于其它药物:过多症、缺乏症。 Ch.P 收载的的维生素制剂有：VA，B1，B2，B6，B12，C，D2，D3，E，K等,40%的谷类和麦类主食,10%乳类制品,10%肉类,蛋类及豆类制品,10%油,脂肪及甜品,18%蔬菜,12%水果,健康的饮食：,如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。 例如: VA 缺乏夜盲症 VB1缺乏脚气病 VD缺乏,脂溶性： 水溶性：,按溶解性分类,VA、VD( D2、D3 )、VE、VK等,B族(B1、B2、B6、B12),VC ,烟酸,叶酸(VitM ),泛酸(VitPP)等,第一节 维生素A的分析,(一)化学结构,R=H VA醇 VA1 R= COCH3 VA醋酸酯 R= COC15H31 VA棕榈酸酯,一结构与性质,结构特点： （1）环己烯+共轭多烯侧链； （2）天然VA侧链为全反式； （3）天然来源主要是鱼肝油，为醋酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人工合成。,1.溶解性： 不溶于水 溶于乙醚，氯仿，异丙醇，环己烷，脂肪和油。,(二).性质,共轭多烯侧链性质非常活泼.,2. 不稳定性,维生素A的氧化产物：,环氧化物, 维生素A醛, 维生素A酸,or,3.与SbCl3作用 Carr-Price反应 鉴别 含量测定max =620nm,具有共轭多烯侧链紫外吸收。 最大吸收波长在325328nm,随VA存在状态以及所用的溶剂,最大吸收波长的位置有所不同,4. 紫外吸收,5. 存在多种立体异构化合物,侧连有4个“=” ,应有 个 目前，包括维生素A在内，共发现有 6种异构体。其它5个异构体活性仅是全反式的15%75%.,新维生素Aa 2-顺式,328, 75%,新维生素Ab 4-顺, 319, 24%,新维生素Ac, 2,4-二顺, 311, 15%,异维生素Aa 6-顺, 323, 21%,异维生素Ab, 2,6-二顺, 324, 24%,维生素A,全反式, 325328, 100%,二. 鉴别试验 (一). 三氯化锑反应 Carr-Price反应,无水,无醇,注：无水，无醇条件,+,+,(SbCl5RCOO)-,蓝色,紫红,(二). 紫外吸收光谱 BP,max为326nm 一个吸收峰,max为350390nm 三个吸收峰,去水VitA（VitA3）,三、 含量测定,紫外分光光度法三点校正法,三点校正法,1.概述 共轭多烯UV特征 相关物质UV特征，对测定有影响。 Morton和Stubbs等人1946年提出了三点校正法。,2. 原理（依据、假定）,物质对光的吸收具有加和性，即,维生素A中的杂质吸收在310340nm范围内近似一条直线，且随着波长增加吸光度减小。,效价为维生素A1的40%，max345350nm,维生素A中的 杂质吸收 1）. 相关物质的吸收,a. 维生素A的衍生物,维生素A2 去氢维生素A,效价低于维生素A1，max385390nm,维生素A3 去水维生素A,d. 鲸醇：VA醇的二聚体，没有生物活性,b. 维生素A的氧化产物： 环氧化物，醛，酸,f. 维生素A的5个异构体,e. 裂解产物： 储存过程中受光照射,以上这些相关物质和不相关物质，在325-328处均有吸收统称为无关吸收或背景吸收，干扰VA的测定。,2）. 不相关物质：抗氧剂和稀释用油,1）. 相关物质的吸收,Ch.P收载有2种方法：,第一法：等波长差法 （适用于酯式维生素A的测定）,第二法：等吸收度法 皂化法,适用于维生素A醇,第一法无法消除杂质干扰时用此法,1)等波长差法： 这两个波长分别在1两侧12nm处，即,1=328nm; 2 =316nm; 3=340nm,2)等吸光度法： VA在这两个波长下的吸光度应该等于1下的吸光度的6/ 7 ，即,1=325nm; 2 =310nm; 3=334nm,4. 吸收度校正公式：,A328 A328(校）,5.维生素A醋酸酯效价计算,效价(IU/g)样= 1900,A,5.维生素AD胶丸中维生素A的标示百分含量计算公式,A,6.,a. 操作方法,1)最大吸收波长确认 max 在326329nm，计算比值差值。 max不在326329nm，第二法测定。,b. 计算方法,2)计算吸收度比及比值差,首先要计算吸收度比值 。,然后计算吸收度的比值差。,判断差值是否超过规定值的,3）计算校正吸收度,吸收度校正公式：,小结： 1. max 在326329nm，计算比值差值。 max不在326329nm，第二法测定。 2. 0.02用 A328 0.02，计算A328校，求 1）3%，用 A328 2）-3%-15%，用A328校 3）-15% or+3%，第二法测定,6.练习题：维生素AD胶丸中维生素A的含量测定 已知：平均胶丸内容物重为0.0815g 维生素A的标示量为10000IU/丸 取样：,求：维生素A的标示百分含量。,测定数据如下表,求：维生素A的标示百分含量。,测定数据如下表,0.04,首先计算吸收度比值和吸收度比值差值。（填于上表）,由此可知，应该用测得的328nm处的吸收度计算。,然后计算校正值与测定值相对偏差,由结果知，需计算校正吸收度。,= 100%,0.1279110010000,0.65210025/20.08151900,=98.7%,=,CL,Amax,A328 A328校,含量（效价）= 1900,注意： C为混合样品的浓度,7. 公式推导：,=,（环己烷)标,（环己烷)样,效价(IU/g)样,效价(IU/g)标,效价(IU/g)样=,效价(IU/g)标,样,标,定义：每一个 数值所相当的效价。,换算因数,维生素A醋酸酯: 1IU=0.344g 全反式VA醋酸酯，则 1g全反式VA醋酸酯相当的国际单位数 为： =10000000.344=2907000 IU /g,维生素A醋酸酯,效价(IU/g)样= 1900,效价(IU/g)样= 1900,求标示量,适用于维生素A醇,第一法无法消除杂质干扰时用此法,第二法（等吸收度法） 皂化法、6/7 A 法 ,水溶性,脂溶性,校正公式 A325（校） =6.815A325-2.555A310-4.260A334,效价(IU/g)样= 1830,8、注意事项 （1）VA遇光易氧化变质，操作应半暗室中快速进行，所用试剂不得含氧化性物质，以防VA紫外线或氧化性物质破坏。,（2）用三校正法测定时，其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处。对波长的正确性要求严格。340nm处，若波长误差0.5nm，可影响结果-3.12.07%。所以测定时所用仪器的波长读数应注意，必要时应作标准。,(3)本法虽已用50多年，但根据杂质吸收近似一直线的不近合理，进行VA含量测定方法的改进，如正交函数分光光度法，卡尔曼滤光分光光度法，高效液相色谱法。,三氯化锑比色法,（二）,优点 简便 快速,max 618 nm 620 nm,标准曲线法,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和 Rf 值,BP 杂质对照品法 显色剂 三氯化锑,（三）TLC法,练习：1.维生素A醋酸酯胶丸含量测定:取内容物39.1 mg,加环己烷溶解并稀释成100ml，在下列五个波长处测得吸收度A值如下：,已知：平均胶丸内容物重为0.08736g;维生素A的标示量为3000 IU/丸. 试求：维生素A的标示百分含量？,A校=0.637 P=-3.9% 90.1%,练习 2. 维生素A醋酸酯胶丸含量测定:取内容物W,加环己烷溶解并稀释成100ml，使其浓度为 9-15IU/mL。已知内容物平均重量为80.0mg，每丸标示量为10 000IU。试计算W范围。,W 10 000,W 10 000,80.0 100,15,9,7.2mgW 12mg,3.三点校正紫外分光光度法测定维生素A醋酸酯的依据是什么？ 4.三点波长分别是多少nm？吸收度校正公式是怎样的？换算因数是多少？ 5. 维生素A的氯仿溶液，加三氯化锑的氯仿溶液，即显色，渐变成色。反应需在条件下进行。此反应称作反应。,第二节 维生素B1的分析,一、化学结构与性质 1.结构：,氯化3-（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基-5-（2-羟乙基）-4-甲基噻唑的盐酸盐, a.氨基嘧啶亚甲基噻唑环季铵化合物 b.碱性基团： 嘧啶环上的氨基 噻唑环上的季铵,可与酸成盐,2. 结构特点：,3.性质,1).溶解性: 易溶于水;水溶液呈酸性 2).UV: max = 246nm 3). 硫色素反应:专属反应 噻唑环OH-/氧化剂硫色素(蓝色荧光）,3.性质,4) N杂环生物碱沉淀试剂组成恒定沉淀； 两个碱性中心非水滴定； 5) 盐根反应硝酸银；,二 鉴别反应： 硫色素反应 VB1噻唑环在碱性条件下开环，与嘧啶环上的氨基环合后，可被铁氰化钾K3Fe(CN)6等一些氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，溶于正丁醇显兰色荧光。,硫色素荧光反应,VB1专属反应，用于鉴别和含量测定。,硫色素,-2H,2H, 沉淀反应 VB1的含氮杂环，能和生物碱沉淀试剂反应产生组成恒定的沉淀鉴别和含量测定。 如：VB1与硅钨酸反应可生成组成一定的沉淀。 重量法测定VB1含量。,沉淀反应： 可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的沉淀 如：与碘化汞钾产生淡黄色沉淀 与碘生成红色沉淀 与硅钨酸生成白色沉淀 与苦味酸生成扇形白色结晶, 硫胺显碱性 具有两个碱性基团: 噻唑环上的季铵 嘧啶环上的氨基 可以和酸成盐。 如：盐酸硫胺、硝酸硫胺。, 加碱分解后与硝酸铅反应 VB1与NaOH试液一起加热，分解产生Na2S，可与Pb(NO3)2反应生成PbS的黑色沉淀。 维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应。,三. 含量测定 非水滴定法（Ch.P所用方法） 硅钨酸重量法 银量法 紫外分光光度法 硫色素荧光法 比色法,(一).非水滴定法： 1）原理：,VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可被高氯酸滴定。,在非水溶液中与HClO4定量反应,2）方法： 溶剂：冰醋酸 指示剂：喹哪定红-亚甲蓝混合指示液 滴定剂：高氯酸 醋酸汞： 空白校正： 终点：紫红天蓝色 T=16.86mg/ml:(反应摩尔比1:2),（二）UV法 适用于 片剂和注射剂,Ph=1,max=246nm, E=421。 pH=7, max=232nm, E=345; max=266nm, E=255,（三）硫色素荧光法,1. 原理,NaOH,2、方法与计算 激发波长 ex=365nm 发射波长 em=435nm,标准对照法 特点 （1）灵敏度高，线性范围宽 （2）适用于VB1和制剂含量,氧化产物不干扰 (3)代谢产物不干扰，适用于体液分析,什么叫做硫色素反应？ 非水滴定法测定时，加入醋酸汞试液的目的,第三节维生素C的分析,一. 化学结构,结构特点： 1. 旋光性 VC分子中具有2个手性C原子，具有4种光学异构体。其中生理活性最强的是L（+）抗坏血酸,D(-)-异抗坏血酸,L(+)-异抗坏血酸,L(+)-抗坏血酸,D(-)-抗坏血酸,+20.5 21.5,0.1g/mL水溶液,2. 酸性,烯二醇结构酸性。 C3-OH， pKa=4.17(共轭效应) C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基) 一元酸. 能与NaHCO3作用生成钠盐。,3. 水解反应:具有内酯结构,L-二酮古罗糖酸 (无生物活性),4. 强还原性 具有烯二醇基。 能够被氧化成去氢抗坏血酸。 5.糖的性质（Molisch） 6.紫外吸收： 0.1mol/L HCl max =245nm 中性溶液 max =265nm 。,二鉴别试验,1.还原性:烯二醇基还原性 如：,2. 荧光反应,3. 糖的性质（Molisch） 类似糖结构，具有糖的性质。, 50 ,水解,脱羧,反应的摩尔比是11,三含量测定,1. 碘量法,a. 原理,b. 操作,终点颜色：无色蓝色 0.05mol/L碘液 T8.806mg /mLC6H8O6,c. 讨论 1）反应条件 酸性 使VC在空气中氧化速度减慢。 2) 溶剂 新沸放冷的水。 减少水中溶解氧的影响。,3)还原性物质的影响及排除 VC注射液中常加有亚硫酸盐如NaHSO3作为抗氧剂. 排除：加入丙酮或甲醛。,+,2. 2,6-二氯吲哚酚滴定法 原理： 在酸性下 氧化型是红色的;还原型是无色的 酸性下直接用2,6-二氯吲哚酚滴定，用滴定剂自身的颜色变化指示终点，不需要另外的指示剂。,三含量测定,终点的颜色是溶液由无色变为红色,氧化型 （红色）,还原型（无色）,+,+,第四节维生素D的分析,一 结构与性质,维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称 目前已知的维生素D类至少十多种。均属于甾醇衍生物。,维生素D2、D3结构相近，D2比D3多一个双键和一个甲基。,性质： （1）脂溶性维生素； （2）旋光性:D2有6个,D35个手性C； （3）不稳定性 遇光、空气及氧化剂氧化变质； （4）显色反应（甾体母核反应）与强酸反应呈色； （5）紫外吸收。,1、显色反应 （1）与醋酐-硫酸反应：维生素D2,D3加氯仿溶解加醋酐和硫酸振摇,呈色。 （2）与三氯化锑反应：维生素D2、D3加1，2二氯乙烷溶解加三氯化锑试液橙红色，逐渐变为粉红色。,二）鉴别,2、维生素D2、D3的区别 取本品10mg溶于96%乙醇10ml中取出0.1ml加乙醇1ml和85%硫酸5ml。 维生素D2显红色，max为570nm 维生素D3显黄色，max为495nm,三）含量测定 VD的含量测定,各国药典方法不一。 USP采用化学法,色谱法和微生物法； BP采用化学法、光谱法和色谱法； Ch.P采用正相高效液相色谱法。,Ch.P采用正相高效液相色谱法。,1）色谱条件： 色谱柱：硅胶为填充剂 流动相：正己烷-正戊醇（997：3） 紫外检测器：波长254nm 2）测定:分第一法、第二法、第三法 无VA及其他物质干扰，采用第一法； 有干扰采用第二法（皂化提取）； 第二法不能消除干扰，采用第三法（柱分离）。,第五节维生素E的分析,一化学结构与性质,名称：消旋dl生育酚醋酸酯 母核：苯骈二氢吡喃衍生物 苯环上有一乙酰化的酚羟基 侧链：脂肪烷烃,二、鉴别试验 1.硝酸反应 本品，无水乙醇溶解，加硝酸，75加热约15分钟，显橙红色。 2.水解后氧化反应(三氯化铁联吡啶反应) 本品，在碱性条件下水解，得生育酚，在联吡啶和三氯化铁试液的作用下，反应产生血红色配离子。,3、UV吸收： VE的0.01%无水乙醇液： max=284nm =41.045.5 min=254nm,三、杂质检查 检查游离生育酚: 275 取0.1g样品，按铈量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定，以二苯胺为指示剂，消耗Ce(SO4)2液不得超过1.0ml。,游离生育酚检查:取0.1g样品,按铈量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定,以二苯胺为指示剂,消耗Ce(SO4)2液不得超过1.0ml,求限量(a.M生育酚=430.7)。,C V M,S, 100%,L=,a,0.01 1.0 430.7,=2.15%, 100%,L=,0.1 1000 2,TV,S, 100%,L=,b,2.1541.0,0.10 1000, 100%,=,=2.15%,b. T=2.154mg/mL,四、含量测定 （一）铈量法 1.原理：VE用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫酸铈定量地氧化为对生育醌，过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点。 终点：亮黄灰紫 空白试验,四、含量测定 （一）铈量法 2. 反应条件 1）VE在H2SO4酸性条件下水解为宜。 碱性溶液中游离生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中进行,如在碱性中会生成碱式盐而影响测定。,2）Ce(SO4)2溶于酸水溶液,不溶于醇,生育酚溶于醇而不溶于水,滴定过程中应有一定浓度的乙醇。 3）本法适用于纯度高的VE供试品。 4)化学计量关系：1：2,CH3,C16H33,+2Ce4+,HO,对生育醌+ 2Ce3+,（二）气相色谱法：Ch.P 1、色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：2m4mmI.D.硼硅玻璃柱， 内装硅藻土（80100目） 固定相：硅酮（OV-17） 涂布浓度 2% 载气：N2 流速:含2%固定相：以1820分钟为宜； 含5%固定相：以3032分钟为宜,柱温：265 内标：正三十二烷 检测器：FID（氢火焰离子化检测器） 性能要求： 理论塔板数n按VE峰计算应不低于500， VE峰与内标物质峰的分离度R应大于2。,2、溶液配制： 内标溶液：正三十二烷的环己烷溶液 （1.0mg/ml） 对照溶液：对照品溶解于内标溶液中 (2.0mg/ml) 供试品溶液：供试品约20mg，用内标溶液，溶解并稀释至10ml,3、供试品测定 mg=fAxMs/As Ax ：供试品峰面积 f：校正因子 As ： 内标物的峰面积 4、特点： （1）简便快速,专属性强,适用于VE、VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定。 （2）需要特殊仪器,鉴别下列药物：,a,b,c,掌握维生素A、B1和C的化学结构与分析方法的关系；维生素A的紫外分光光度法和维生素C的碘量法。 熟悉维生素C的2,6-二氯靛酚滴定法。 了解维生素D和E的化学结构与分析方法的关系。,基本要求,1 在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水后，加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是 A. 氯氮卓 B. 维生素 A C. 普鲁卡因 D. 盐酸吗啡 E. 维生素 C,E,2 中国药典（2005年版）采用以下何法测定维生素E含量 A. 酸碱滴定法 B. 氧化还原法 C. 紫外分光光度法 D. 气相色谱法 E. 非水滴定法,D,3 中国药典（2005年版）采用气相色谱法测定维生素E含量，内标物质为 A. 正二十二烷 B. 正二十六烷 C. 正三十烷 D. 正三十二烷 E. 正三十六烷,D,4. 下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是 A. 维生素A B. 维生素B1 C. 维生素C D. 维生素D E. 维生素E,B,5 既具有酸性又具有还原性的药物是 A. 维生素A B. 咖啡因 C. 苯巴比妥 D. 氯丙嗪 E. 维生素C,E,6. 维生素C的鉴别反应，常采用的试剂有 A. 碱性酒石酸铜 B. 硝酸银 C. 碘化铋钾 D. 乙酰丙酮 E. 三氯醋酸和吡咯,ABE,7. 测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了 A. 保持维生素C的稳定 B. 增加维生素C的溶解度 C. 使反应完全 D. 加快反应速度 E. 消除注射液中抗氧剂的干扰,E,8. 能发生硫色素特征反应的药物是 A. 维生素A B. 维生素B1 C. 维生素C D. 维生素E E. 烟酸,B,9 使用碘量法测定维生素C的含量,已知维生素C的分子量为176.13，每1ml碘滴定液(0.05mol/L) 相当于维生素C的量为 A. 17.61mg C. 176.1mg D. 88.06mg E. 1.761mg,B. 8.806mg,B,10：121125（10：121125） 可发生以下反应或现象的药物为 A.维生素B1 B.维生素C C.两者均能 D.两者均不能 121.与碘化汞钾生成黄色沉淀 122.麦芽酚反应 123.在乙醚中不溶 124.与2,6-二氯靛酚反应使颜色消失 125.硫色素反应,A,D,C,B,A,11 维生素A的鉴别试验为 A. 三氯化铁反应 B. 硫酸锑反应 C. 2,6-二氯靛酚反应 D. 三氯化锑反应 E. 间二硝基苯的碱性乙醇液反应,D,12 中国药典（2005年版）规定维生素A的测定采用紫外分光光度法（三点校正法），此法又分为 A等波长差法 B等吸收度法 C6/7 A法 D差示分光法 E双波长法,AB,13 维生素E的鉴别试验有 A硫色素反应 B硝酸氧化呈色反应 C硫酸-乙醇呈色反应 D碱性水解后加三氯化铁乙醇 液与2,2-联吡啶乙醇液呈色反 应 EMarquis反应,BD,14. 下面哪些描述适用于维生素A A. 分子具有长二烯醇侧链，易被氧化 B. 具有较长的全反式共轭多烯结构 C.含酯键，经水解后产生苯并二氢吡喃衍 生物，易被氧化 D.与三氯化锑的无醇氯仿液中呈不稳 定兰色，很快转变为紫红色 E.样品用无水乙醇溶解后，加硝酸加 热后，呈橙红色,BD,16（ ） 维生素A分子中由于具有共轭多烯侧链，因而其性质很稳定，不易被氧化变质。,维生素A与 反应即显蓝